大鼠血管組織提取物體外控制間質干細胞轉向內皮細胞的分化研究

梁曉鵬，田力

1.遼寧何氏醫學院組織工程實驗室，遼寧沈陽 110000；2.沈陽醫學院臨床教研室，遼寧沈陽 110000

大鼠血管組織提取物體外控制間質干細胞轉向內皮細胞的分化研究

梁曉鵬1，田力2

1.遼寧何氏醫學院組織工程實驗室，遼寧沈陽 110000；2.沈陽醫學院臨床教研室，遼寧沈陽 110000

目的 研究大鼠血管組織提取物于體外誘導骨髓間質干細胞（MSCs）向內皮細胞的分化能力。方法 2015年6—9月間使用淋巴細胞專用分離液對15例大鼠MSCs進行分離，以貼壁法行培養擴容，再采用流式細胞法檢測MSCs的表層抗原水平，以基礎培養液為實驗A組，以含熱處理的血管組織細胞提取物的培養液為實驗B組，以含大鼠血管組織細胞提取物的培養液為實驗C組，以含原代血管內皮組織細胞提取物的培養液作為實驗D組，將第4代MSCs分別加入四組進行分化培養，分析對比細胞的表達變化，并檢測內皮組織細胞于特異性標志物之變化表達。結果 實驗C組的MSCs的細胞形態未見顯著改變，但細胞內的基因表達可見明顯改變，內皮細胞的特異性基因CD144、CD34、CD31以及eNOS（endothelial nitric oxide synthase）出現高表達。結論 血管組織細胞的提取物中含有能夠誘導大鼠MSCs向內皮組織細胞分化的成份，提示成體細胞的內組成份對于相鄰干細胞之分化結果具有至關重要的控制作用。

骨髓間充質干細胞；組織細胞提取物；血管內皮細胞；分化

髓間充質干細具有低免疫原、高增殖能力及多向分化性的特點而受到廣泛關注，近些年來國外對于自體的MSCs醫治心梗與缺血性疾病方面已有深入研究，但國內仍處于初級階段[1]。MSCs具備多向分化的隱性能力，于適當條件誘導下可分化為同源性胚層間質組織細胞，并可分化為突破胚層的非中胚層間質組織細胞[2]。該研究旨在分析血管組織提取物于體外對于MSCs分化的影響，于2015年6—9月間以15例大鼠作為研究對象進行相關實驗研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將制備的第4代MSCs分別加入4種誘導分化培養基中誘導分化，設置為4個實驗組，以單純基礎培養液為實驗A組，以血管組織的上清液加熱至沸點15 min后立即以冰浴冷卻加入至培養液中為實驗B組，以血管組織的上清液加入培養液中為實驗C組，以同條件下培養的原代血管內皮細胞上清液加入培養液中為實驗D組（陽性對照組），各組體積數均相等；行基因特異性表達分析。各組均每隔2～3 d更換培養液1次，誘導培養均進行7～14 d；待細胞培養生成單層，細胞增殖至完全覆蓋瓶底80%時，以0.125%的胰酶進行消化傳代培養。

1.2 材料

選用上海加科出品的SD大鼠、杭州四季青出品的胎牛血清、Hyclone鏈霉素-青霉素雙抗、Amresco蛋白酶抑制劑，Gibco：DMEM培養基含1.0 g/L葡萄糖、淋巴組織細胞分離溶液、混合性膠原酶與胰蛋白酶，Trizol、Invitrogen-Reagent、Promega-Taq DNA polymerase、BBI-DNA marker、Promega-d NTPs、Invitrogen-M-MLV Reversetranscriptase、瓊脂糖、瓊脂粉、DEPC。

1.3 方法

大鼠MSCs的分離與培養，按SD大鼠體重以50 mg/kg比例給予戊巴比妥鈉（國藥準字H31021724）腹腔注射麻醉，于無菌條件下剝離出股骨與脛骨，切除兩端干骺端充分顯露出骨髓腔。以10%的胎牛血清、加入雙抗的DMEM 100 U/mL配制為含20%肝素的基礎培養液，用基礎培養液對骨髓腔進行反復沖洗，制備細胞混懸液，將混懸液滴注于離心管內同體積的淋巴組織細胞分離液的上層，1 500 rpm離心20 min，離心后離心管內可見4層物質，采集中部交界處的乳白色個體核細胞層，以基礎培養液定容至6 mL，離心5 min，棄上清液，注入基礎培養液配制為個體核細胞的懸液，計數。將個體核細胞按1×105cells/mL的密度種植于培養瓶內，于37℃的5%CO2培養箱之中進行培養，24 h后將未貼壁的細胞懸液吸出再次培養，培養基每隔3 d進行1次換液，2周后當貼壁細胞計數達融合90%程度時以0.125%的胰酶消化，以1∶3進行傳代，定期采取處于生長狀態下的細胞倒置，使用倒置相差型顯微鏡觀察細胞形態。

血管細胞組織提取物的制備，于無菌環境下剝離取得大鼠的新鮮血管細胞組織，使用PBS將新鮮血管細胞組織反復沖洗3次，徹底清除表層附著物。將新鮮血管細胞組織剪碎，置于0.5%的混合性膠原酶中在37℃條件下消化6 h。離心后去上清，以0.25%胰蛋白酶再次消化。離心后采集沉淀細胞，以1∶100蛋白酶抑制液、含重懸細胞的細胞裂解液，超聲裂解細胞，在4℃下，定容14 000 g離心15 min，離心兩次。收集血管細胞組織的上清液于無菌條件以0.22 um過濾器進行過濾，靜置于4℃的冰箱內保存待用。

1.4 鑒定細胞分化

使用流式細胞分析儀進行細胞表型分析，檢測mRNA水平鑒定內皮細胞的特異性基因是否可見表達，據此判斷MSCs是否朝向血管的內皮細胞產生分化。引物序列為CD31、CD34、CD144、eNOS以及β-actin。

2 結果

2.1 大鼠MSCs表型與表層抗原結果

于倒置相差型顯微鏡下所見，大鼠的MSCs經傳代培養后呈現為扁平或者多角形，旺盛生長時可呈現為旋渦狀。細胞密度升高時胞體形狀變為細長，其形態與纖維細胞相似，具體形態見圖1。

圖1 傳代培養后的大鼠MSCs

圖2 細胞表層抗原檢測

傳至P4第4代時，以流式細胞儀對細胞表層標志物的表達進行分析，結果為MSCs表層抗原細胞CD90與CD73為陽性，CD34呈陰性表達。提示P4代的細胞屬于較為純化的MSC見圖2。

2.2 誘導后分化細胞的形態學結果

經誘導培養，A、B、C 3組的細胞表層形態未見顯著改變，且生長均旺盛，隨著傳代代數的增加，扁平細胞可見升高，細胞呈明顯衰老的狀態。

2.3 誘導后分化內皮細胞的特征性基因表達結果

誘導分化后2周，分別提取4組實驗細胞的RNA，以RT-PCR對內皮細胞的特征性基因表達進行檢測，結果說明加入了血管組織細胞上清液C組與原代培養的內皮細胞D組內，均可見CD144、CD33、CD31及eNOS一氧化氮合酶的表達，未添加血管細胞組織上清液的A組與熱處理的B組內則均未見相關基因的表達或者表達量微小，具體情況見圖3。

圖3 誘導后分化內皮細胞的特征性基因表達結果

3 討論

MSCs是一組存在于滑膜、骨髓、脂肪等機體多項間質組織中的多功能干細胞，但通常于骨髓中分離獲得。近年來，組織工程研究成為一項重點項目，間質干細胞成為當前最常用的一種種子細胞。有研究表明，來源于骨髓間質干細胞MSCs可于局部微環境的干預下重新編程，在體外可定向分化成為脂肪細胞、肌肉細胞、成骨細胞、軟骨細胞、成纖維細胞以及內皮細胞等[3-5]。劉四紅等[6]指出將成骨細胞與內皮細胞進行聯合培養，在促進骨形成的同時也能夠促進血管的形成。因此體外誘導分化內皮細胞具有重要的臨床應用價值。也提示細胞的外基質部分對于干細胞的結局具有關鍵作用。該次研究于含有內皮細胞提取物的培養誘導溶液中對間質干細胞進行培養，使其于培養14 d后出現內皮細胞的特異標志物表達，印證了MSCs分化的方向不但取決于細胞的外基質環境，并且也可受到環境與成體細胞內的誘導因子干預，分離并鑒別這些相關的誘導因子，對于間質干細胞未來于臨床上應用具有不可或缺的意義。

細胞表層分子是細胞分化與定型的一種標志物。MSCs通常不發生分化表達的相關標志有Ⅰ～Ⅲ型膠原、和（或）堿性的磷酸酶等，細胞培養至貼壁附著時，細胞可見 均 一 表 達 的 有 CD44、CD90、CD73、CD124、CD105、CD120a等多種表層蛋白[7-10]。目前對于MSCs的表層特異標志物仍存在 許多不同觀點，認識尚未完全明確。本次實驗中選擇CD73與CD90作為MSCs的表層特征分子行細胞的鑒定。CD144、CD31、CD34及一氧化氮合酶等是血管內皮組織細胞廣泛認可的特異標志物[11-14]。梁峰等[15]研究結果表明誘導7 d后可見CD34、CD31、F1K-1以及vWF的陽性表達。與該次研究結果相符。該組研究采用胰酶與膠原酶與徹底清除了細胞的外基質相關成份。而后裂解了內皮細胞組織，充分顯露其內容物，使其可與間質干細胞直接結合，成功的將其誘導分化為能夠發生血管內皮組織細胞特異標志物表達的細胞，證實了MSCs具有多向分化的潛能，同時也印證了MSCs的誘導條件與分化機制十分復雜，過程中可被諸多因素所左右。在圖3中能夠看出，熱處理后的血管細胞上清液對MSCs進行誘導分化培養后，可見CD31與CD34有部分表達，分析其原因可與血管細胞組織提取物中所含有的非蛋白質型誘導因子或蛋白因子的不完全變性，使MSCs發生部分分化有關。

綜上所述，以大鼠血管組織提取物在體外可誘導間質干細胞朝向內皮細胞分化，MSCs可于體外培養擴增，能夠作為組織工程法建構血管的一項種子細胞，對于未來應用于臨床血管相關疾病或外傷均具有重要意義。

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Study on the Control of the Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Into Endothelial Cells in the Blood Vessel Tissue of Rats

LIANG Xiao-peng1，TIAN Li2
1.Tissue Engineering Laboratory of Ho's Medical College in Liaoning，Shenyang,Liaoning Proivnce,110000 China；2.Department of Clinical Laboratory,Shenyang Medical College，Shenyang,Liaoning Proivnce,110000 China

Objective To study the vascular tissue of rats to extract inducing bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs)into endothelial cells differentiation.Methods From June to September 2015 using a separate liquid special for separation of 15 cases of lymphocytes in MSCs rats by adherent culture expansion,then the surface antigen level and flow cytometry was used to detect MSCs,in the basic culture medium as experimental group A,in cultured vascular tissue cell extracts containing heat treatment for the experimental group B in the medium containing vascular tissue,cell extracts of rats as experimental group C,with the medium containing primary vascular endothelial cells extract as experimental group D,the fourth generation of MSCs were added to the four group of differentiation and expression analysis of comparative cell change,and detect the endothelial cells on specific markers the change of expression. Results The cell morphology in experimental group C MSCs no significant changes,but the genes within the cell Expression of visible change obviously,endothelial cell specific gene CD144,CD34,CD31,and eNOS appear high expression.Conclusion Vascular tissue and cell extracts containing can induce rat MSCs to the composition of the endothelial cell differentiation,it was suggested that the somatic components to adjacent stem cell differentiation results have important role in controlling.

Bone marrow mesenchymal stem cells；Mesenchymal stem cells；Cell extracts；Endothelial cell differentiation

R3；R74

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2016.02.03.20

2016-07-12；

2016-08-09

梁曉鵬（1978.10-）,男，遼寧沈陽人，碩士，中級工程師,研究方向：干細胞誘導分化。