丹參藥渣中丹參酮類(lèi)化學(xué)成分的提取富集研究及其利用途徑分析△

戴新新，沈飛，宿樹(shù)蘭*，段金廒*，唐志書(shū)，趙步長(zhǎng)，王明耿

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心 中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；3.山東菏澤步長(zhǎng)藥業(yè)股份有限公司，山東 菏澤 274000)

丹參藥渣中丹參酮類(lèi)化學(xué)成分的提取富集研究及其利用途徑分析△

戴新新1，沈飛1，宿樹(shù)蘭1*，段金廒1*，唐志書(shū)2，趙步長(zhǎng)3，王明耿3

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心 中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；3.山東菏澤步長(zhǎng)藥業(yè)股份有限公司，山東 菏澤 274000)

目的：對(duì)丹參藥渣中丹參酮類(lèi)成分的提取富集工藝進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)一步對(duì)其開(kāi)發(fā)利用進(jìn)行分析。方法：采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以總丹參酮的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選丹參藥渣的最佳提取工藝條件；采用溶劑沉淀法純化富集丹參酮類(lèi)成分。結(jié)果：丹參藥渣中丹參酮類(lèi)成分的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%，10倍乙醇用量，提取2 h，提取2次；通過(guò)水沉淀法可以去除丹參粗提物中大多數(shù)的水溶性成分，純化制備丹參酮類(lèi)化學(xué)成分，其中提取物中總丹參酮的含量為1.752%，是原提取物含量的7.5倍。結(jié)論：本文優(yōu)選了丹參藥渣中總丹參酮的最佳提取工藝，并采用水沉淀去除部分水溶性成分，從而富集純化丹參酮類(lèi)成分。建立了采用HPLC同時(shí)測(cè)定丹參藥渣中總丹參酮含量的方法，操作簡(jiǎn)便快速、重現(xiàn)性好，為丹參藥渣的資源化利用及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)與參考。

丹參藥渣；丹參酮；提取制備；純化工藝

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功能[1]。用于瘀血閉阻所致的胸痹及中風(fēng)、冠心病、心絞痛、心肌梗死等癥的治療[2]。丹參中的資源性化學(xué)成分主要包括脂溶性和水溶性成分[1，3]，脂溶性的丹參酮類(lèi)化合物主要包括丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ等，具有抗氧化[4]、心血管藥理作用[5]、抗菌消炎作用[6]以及抗腫瘤作用[7]等多種生物活性。丹參類(lèi)注射液制備生產(chǎn)過(guò)程主要采用水提醇沉工藝，致使脂溶性成分丹參酮類(lèi)殘留在藥渣中，未得到充分利用導(dǎo)致丹參資源性化學(xué)物質(zhì)的浪費(fèi)和資源利用效率低，同時(shí)造成環(huán)境污染。該問(wèn)題已引起政府、相關(guān)部門(mén)以及從事中醫(yī)藥研究的科技工作者的關(guān)注和高度重視。

本文在前期研究基礎(chǔ)上，建立同時(shí)測(cè)定丹參藥渣中二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮的HPLC-PDA分析方法，研究發(fā)現(xiàn)丹參藥渣中殘留大量的丹參酮類(lèi)資源性化學(xué)成分。為了有效利用丹參酮類(lèi)化學(xué)成分，本文采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化丹參藥渣中丹參酮類(lèi)成分的提取工藝條件，以總丹參酮類(lèi)成分含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，明確有利于生產(chǎn)、節(jié)約成本的最佳提取工藝，并采用溶劑沉淀法純化富集丹參酮類(lèi)成分，為丹參藥渣的資源化利用、利用價(jià)值發(fā)現(xiàn)以及資源產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

美國(guó) Water 2695 高效液相色譜系統(tǒng)，Water 2998 PDA檢測(cè)器，Empower數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)，F(xiàn)W80型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)，ML204/02、MS205電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，DHG-9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，TDL-80-2B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器有限公司)，KH-500型超聲波清洗儀器(昆山禾創(chuàng)聲波儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥材

甲醇(南京化學(xué)試劑有限公司)、甲酸(MERCK)均為分析純，乙腈(美國(guó)TEDIA公司)為色譜純?cè)噭６涞⑼?南京春秋生物工程有限公司，批號(hào)：20140516)，丹參酮Ⅰ(批號(hào)：110867-200406)、隱丹參酮(批號(hào)：110852-200806)和丹參酮ⅡA(批號(hào)：110766-200619)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，無(wú)水碳酸鈉(南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：14042210905)，水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。丹參固體廢棄物在2014年3月收集于菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司。

2 方法

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)試單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及參考相關(guān)文獻(xiàn)[8-10]，對(duì)影響丹參酮提取量較大的幾個(gè)因素：乙醇用量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)、提取時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以總丹參酮的含量為觀察指標(biāo)，選擇乙醇用量、提取次數(shù)、提取時(shí)間及乙醇體積分?jǐn)?shù)為考察因素[11]，以L(fǎng)9(34)方法設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 丹參酮類(lèi)成分提取試驗(yàn)因素水平表

2.2 提取工藝

丹參藥渣(水提后)60 ℃溫度下烘干后，取干燥藥渣打粉，過(guò)20 mesh篩，準(zhǔn)確稱(chēng)取丹參藥渣30 g，共計(jì)9份，按正交試驗(yàn)因素水平表?xiàng)l件提取，濾紙過(guò)濾得到濾液后濃縮，最終得到干燥固體物，精密稱(chēng)取適量固體，置500 mL量瓶中，加乙醇溶液溶解至刻度，搖勻，作為供試品溶液，取上清液過(guò)0.22 μm的濾膜，進(jìn)樣。

2.3 純化工藝

2.3.1 丹參藥渣醇提取液的制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取丹參藥渣粉末17 g，共計(jì)6份，分為3組，每組平行2份，分別為對(duì)照組、水沉淀組、碳酸鈉沉淀組，均采用正交試驗(yàn)中總丹參酮的最佳提取工藝提取，濾紙過(guò)濾得到濾液后濃縮，得丹參藥渣濃縮液。

2.3.2 溶劑沉淀法 對(duì)照組將濃縮液水浴揮干，在105 ℃干燥 3 h至恒重，精密稱(chēng)量固形物重量；水沉淀組加適量的超純水，4 ℃冷藏24 h，使完全沉淀，濾紙過(guò)濾得沉淀，在105 ℃干燥3 h至恒重，精密稱(chēng)量固形物重量；碳酸鈉沉淀組加適量8%碳酸鈉溶液，4 ℃冷藏24 h，使完全沉淀，濾紙過(guò)濾得沉淀，在105 ℃干燥3 h至恒重，精密稱(chēng)量固形物重量。分別精密稱(chēng)取上述固形物適量，加甲醇溶解并稀釋。取上清液過(guò)0.22 μm的濾膜，進(jìn)樣。計(jì)算固形物中指標(biāo)成分的含量及在固形物中的含量。

2.4 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱(chēng)取二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，用甲醇配成質(zhì)量濃度分別為0.024 8、0.152、0.209、0.126 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.5 色譜條件

色譜柱：BDS HYPERSIL C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。以乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫：0～8 min，15%A；8～9 min，15%～28%A；9～20 min，28%A；20～22 min，28%～54%A；22～28 min，54%A；37～38 min，54%～60%A；38～43 min，60%～68%A；43～48 min，68%～70%A；48～52 min，70%～15%A，樣品的HPLC色譜如圖1所示。

注：A.丹參對(duì)照品，B.丹參藥渣；1.二氫丹參酮Ⅰ；2.丹參酮Ⅰ；3.隱丹參酮；4.丹參酮ⅡA。圖1 丹參對(duì)照品及丹參藥渣的HPLC圖

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 取適量二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA對(duì)照品，進(jìn)樣1、2、5、10、20 μL；按2.5項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣記錄峰面積積分值。以峰面積積分值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度C為橫坐標(biāo)，得二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的回歸方程。

2.6.2 重復(fù)性試驗(yàn) 按照2.2項(xiàng)方法制備6份樣品溶液，按2.5項(xiàng)下色譜條件測(cè)定二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的含量，計(jì)算其RSD。

2.6.3 精密度試驗(yàn) 連續(xù)進(jìn)樣對(duì)照品液6次，按2.5項(xiàng)下色譜條件測(cè)定二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的含量，計(jì)算其RSD。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、20 h進(jìn)樣，按2.5項(xiàng)下色譜條件每隔4 h，對(duì)同一批供試品溶液測(cè)定1次，測(cè)定6次，計(jì)算其RSD值。

2.6.5 回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)定已知含量的樣品3份，加入適量對(duì)照品，混勻，按照2.2項(xiàng)方法處理，測(cè)定有效成分的含量，計(jì)算加樣回收率。

2.7 樣品分析測(cè)定

精密吸取樣品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，計(jì)算樣品中二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學(xué)考察

通過(guò)測(cè)定線(xiàn)性關(guān)系、穩(wěn)定性、重復(fù)性及精密度，對(duì)所建立的HPLC-PDA方法進(jìn)行驗(yàn)證考察，表2測(cè)定結(jié)果顯示，所測(cè)得化合物其RSD小于5%，回收率在94.63%～102.1%，RSD小于2.23%。以上結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)可以用于樣品中這4個(gè)丹參酮成分的檢測(cè)。

3.2 丹參藥渣中各類(lèi)成分正交試驗(yàn)結(jié)果

參藥渣中各類(lèi)成分正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

3.3 總丹參酮的正交試驗(yàn)結(jié)果

總丹參酮的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析見(jiàn)表5。由結(jié)果可知，乙醇含量、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)總丹參酮的提取結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中影響因素由高到低依次為B、D、C、A，最佳水平為A1B2C2D2，乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%，10倍乙醇用量，提取2 h，提取2次。

表2 線(xiàn)性回歸方程、穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性和回收率試驗(yàn)

表3 正交試驗(yàn)測(cè)定丹參廢棄物中丹參酮成分含量 /mg·g-1

表4 總丹參酮正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 方差分析

3.4 溶劑沉淀法結(jié)果

溶劑沉淀法純化丹參藥渣中丹參酮類(lèi)成分結(jié)果見(jiàn)表6。由結(jié)果可知，通過(guò)溶劑沉淀法可以去除丹參粗提物中大多數(shù)的水溶性成分，純化制備丹參酮類(lèi)化學(xué)成分，其中水沉淀法中總丹參酮提取率是原來(lái)粗提物含量的7.5倍。

表6 溶劑沉淀法純化丹參藥渣中丹參酮類(lèi)成分含量 (%)

4 討論

4.1 提取溶劑的選擇

丹參酮類(lèi)成分為脂溶性成分，易溶于甲醇、乙醇、三氯甲烷等有機(jī)溶劑，不溶于水，考慮到工業(yè)擴(kuò)大生產(chǎn)的適用性和可行性，本實(shí)驗(yàn)工藝采用乙醇作溶劑，并優(yōu)化其乙醇濃度，優(yōu)選出經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的丹參酮類(lèi)物質(zhì)提取溶劑。

4.2 提取純化工藝的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)以總丹參酮為指標(biāo)，考察其最佳提取工藝，發(fā)現(xiàn)乙醇用量和乙醇濃度是影響提取效果的關(guān)鍵因素，最終確定了適應(yīng)總丹參酮的最佳提取工藝，10倍量的90%乙醇水溶液，提取2次，每次2 h。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)溶劑沉淀法進(jìn)一步純化丹參藥渣中的丹參酮類(lèi)成分，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水沉淀法可去除丹參粗提物中大多數(shù)的水溶性成分，純化制備丹參酮類(lèi)化學(xué)成分，其中總丹參酮提取率是原來(lái)粗提物含量的7.5倍。研究結(jié)果為丹參藥渣中丹參酮類(lèi)資源性化學(xué)成分的綜合開(kāi)發(fā)利用和精細(xì)化利用提供了科學(xué)依據(jù)，為提升丹參資源的利用效率提供了可行性制備工藝。研究中采用的溶劑沉淀法純化丹參酮類(lèi)成分后，更有利于其進(jìn)一步精制制備，以提高丹參酮類(lèi)成分的純度和利用價(jià)值，為丹參藥渣的產(chǎn)業(yè)化及高值化利用提供了研究基礎(chǔ)。

4.3 丹參酮類(lèi)成分的利用途徑與價(jià)值

現(xiàn)代研究表明，丹參酮類(lèi)成分具有抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降低心肌耗氧量及抗菌、抗炎等多種生物活性和應(yīng)用價(jià)值，尤其是其在抗腫瘤活性方面尤為突出[12]。郝文慧等[13]研究表明，丹參酮類(lèi)成分具有顯著的抗腫瘤活性，具有良好的開(kāi)發(fā)前景。目前含有丹參酮類(lèi)的藥品也有很多種，主要有丹參酮片、丹參酮膠囊、丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液、丹參酮油膏、丹參舒心膠囊、復(fù)方丹參滴丸、丹參舒心片、精制冠心片等[14]。此外，丹參酮類(lèi)成分在保健產(chǎn)品、化妝品等領(lǐng)域亦顯示出廣泛的應(yīng)用價(jià)值，這將有助于拓展丹參酮類(lèi)的利用途徑，提升丹參資源的利用效率，有助于丹參酮類(lèi)資源性化學(xué)物質(zhì)的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)及產(chǎn)業(yè)鏈延伸。同時(shí)，丹參資源的綜合利用更有利于生態(tài)效益與社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益的平衡與協(xié)調(diào)發(fā)展。

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StudyonEnrichmentofTanshinonesinSalviamiltiorrhizaResiduesandApplicationAnalysis

DAI Xinxin1，SHENFei1，SUShulan1*，DUANJin’ao1*，TANGZhishu2，ZHAOBuchang3，WANGMinggeng3

(1.JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，NationalandLocalCollaborativeEngineeringCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationandFormulaeInnovativeMedicine，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China；2.ShanxiUniversityofChineseMedicine，Xianyang712046，China；3.ShandongBuChangPharmaceuticalCompanyLimited，Heze274000，China)

Objective：To optimize the extraction and enrichment process of tanshinones in the Salvia miltiorrhiza residues. and analysis the development and utilization of Salvia miltiorrhiza residues for further.Methods：The extraction conditions ofSalviadregs was optimized by using the L9(34) orthogonal test，with the amount of total tanshinone as evaluation index.Tanshinones were purified and accumulated by solvent precipitation.Results：The optimum parameters for extraction process of the total tanshinone were as follows：10 times amount of 90% ethanol，extracting for 2 times，each time 2 h.Water precipitation could enrich salvianolic acids.The content of the total tanshinone was 1.752%，7.5 times as in original crude extracts.Conclusion：This paper select the best extracting technology of tanshinones in in the Salvia miltiorrhiza residues, and uses the water precipitation to remove part of the water soluble component, purification and enrichment tanshinones. and established a method for determination of tanshinones from Salvia miltiorrhiza residues in content by HPLC method, and this method is simple, fast and reproducible, and can be a reference for the quality control of the extract of Salvia miltiorrhiza residues.and provide scientific basis and reference for the resource utilization and quality control of Salvia miltiorrhiza residues.

SalviamiltiorrhizaBge.dregs；tanshinones；extraction preparation；purification process

2016-01-13)

江蘇省“333高層次人才培養(yǎng)工程”資助項(xiàng)目(BRA2015391)；江蘇高校中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心建設(shè)重點(diǎn)項(xiàng)目(ZDXM-2-5)

*[通信作者] 宿樹(shù)蘭，副教授，研究方向：中藥資源化學(xué)與方藥功效物質(zhì)基礎(chǔ)， E-mail：sushulan@njutcm.edu.cn；段金廒，教授，博士生導(dǎo)師，中國(guó)自然資源學(xué)會(huì)中藥及天然藥物資源研究專(zhuān)業(yè)委員會(huì)主任委員，國(guó)家“973計(jì)劃”項(xiàng)目首席科學(xué)家，研究方向：中藥資源化學(xué)與資源循環(huán)利用，Tel：(025)85811116，E-mail：dja@njutcm.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.010