艾納香口腔護理液抗口腔黏膜潰瘍的藥效學研究△

鄒婧，王凱，李海艷，陳艷，武璞，龐玉新*

(1.中國熱帶農業科學院 熱帶作物品種資源研究所 農業部華南作物基因資源與種質創制重點開放實驗室，海南 儋州 571737；2.廣東藥學院 中藥學院，廣東 廣州 510006；3.海南省艾納香工程技術研究中心，海南 儋州 571737)

艾納香口腔護理液抗口腔黏膜潰瘍的藥效學研究△

鄒婧1，2，3，王凱1，3，李海艷1，2，3，陳艷1，2，3，武璞1，3，龐玉新1，3*

(1.中國熱帶農業科學院 熱帶作物品種資源研究所 農業部華南作物基因資源與種質創制重點開放實驗室，海南 儋州 571737；2.廣東藥學院 中藥學院，廣東 廣州 510006；3.海南省艾納香工程技術研究中心，海南 儋州 571737)

目的：探討艾納香口腔護理液在口腔黏膜潰瘍藥效學中的作用，為艾納香口腔護理液的后期臨床應用提供參考依據。方法：采用改良陳謙明法對SD大鼠構建口腔潰瘍模型，考察艾納香口腔護理液對大鼠組織的病理變化、潰瘍愈合時間及口腔潰瘍組織中的MDA、NO、NOS及SOD含量活性的影響。結果：艾納香口腔護理液組(低、中、高)的愈合時間較潰瘍組和溶劑對照組的愈合時間短，且與陽性藥物組間均無明顯差異；給藥后的第2、4天，艾納香口腔護理液組(低、中、高)較潰瘍自然愈合組NO、NOS、MDA含量顯著降低(P<0.05)；SOD含量顯著升高(P<0.05)；與正常組和陽性藥物組之間無統計學差異(P>0.05)。結論：艾納香口腔護理液能有效縮短口腔潰瘍愈合時間，對口腔潰瘍的愈合起到了較好的促進作用。

艾納香口腔護理液；愈合時間；NO；NOS；MDA；SOD

眾所周知，口腔潰瘍是最常見的口腔黏膜疾病之一，其患病率高達20%左右，居口腔黏膜病首位[1]。目前，關于口腔潰瘍的發病因素有較多的不同報道，由于其病因復雜，又存在著明顯的個體差異，因而推測可能是由多因素綜合作用的結果導致其發生[2]。而大量的動物實驗和臨床實踐證實，氧自由基可能是眾多導致口腔潰瘍因素中共同作用的樞紐環節[3-4]。

艾納香Blumeabalsamifera(L.)DC.為菊科艾納香屬多年生木質草本植物，主要分布于我國海南、貴州、云南等省，以其全草或地上部分入藥，在多個少數民族地區有著悠久的用藥歷史，是一種重要而實用的民間藥物[5-6]。艾納香性溫味辛、苦，具有開竅醒神、鎮痛活血、去痰止咳、治療皮膚燒燙傷、曬后修復及透皮促滲透等多種功效，其主要含有揮發油和黃酮類成分，具有較好的抑菌止癢、抗氧化、鎮痛等藥理活性[7-9]。艾粉為艾納香葉片水蒸氣蒸餾法所得的提取物，其主要成分為左旋龍腦，并含樟腦、異龍腦、β-石竹烯和花椒油素等[10]。

本研究中的艾納香口腔護理液是以艾納香提取物艾粉為主要原料，將其用表面活性劑聚氧乙烯氫化蓖麻油40(RH40)及適量15%乙醇混合溶解后，與質量分數為0.2%的天然抑菌劑A.SAP、保濕劑、 甜味劑等其他添加劑按比例充分混合，再用15%乙醇定容至50 mL，靜置、濾過、灌裝，即得[11]。為了使艾納香口腔護理液更好地應用于市場，保障其療效可靠，本實驗針對艾納香口腔護理液研究了其抗口腔黏膜潰瘍的藥效學，為其在治療口腔潰瘍的療效上提供保障，并為后期臨床應用及市場開發提供依據。

1 材料與儀器

1.1 動物

Sprague-Dawley(SD)大鼠112只，SPF級，6周齡，體質量(180±20)g，雌雄各半；購于湖南省長沙市天勤生物技術有限公司，質量合格證號：43006700005589，許可證號：SCXK(湘)2014-0011。統一由動物實驗中心單籠顆粒飼料飼養，自由飲水，室溫為(22±2) ℃，濕度平均為50%～70%。

1.2 藥物與試劑

艾納香口腔護理液(實驗室自制)[11]；金喉健噴霧劑(貴州宏宇藥業有限公司，批號：161038)；10%水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20121026)，多聚甲醛(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20140512)，10 mmol·L-1甲基紫精溶液(上海將來實業股份有限公司，批號：A003350)，一氧化氮(NO，批號：20150405)、一氧化氮合酶(NOS，批號：20150330)、丙二醛(MDA，批號：20150408)、過氧化物歧化酶(SOD，批號：20150407)測定試劑盒，均購自南京建成生物實驗材料研究所。

1.3 儀器

Axio Imager M2全自動正置多功能顯微鏡(德國ZEISS公司)；TGL-16G高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；FSH-Ⅱ型電動勻漿器(江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠)；ELX800酶標儀(美國BioTek公司)；UV-2102PCS型紫外可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司)；CPA225D型精密電子分析天平(賽多利斯儀器系統有限公司)；RM2235型手動輪轉式切片機(Leica公司)。

2 方法

2.1 實驗動物分組及給藥

取SD大鼠133只，在1周適應性飼養及光照節律正常后隨機均分為7組，即正常組、潰瘍自然愈合組，15%乙醇溶劑對照組，金喉健噴霧劑陽性對照組，艾納香口腔護理液低、中、高3個劑量組。正常組不做任何處理，余下的6組均采用改良后的陳謙明法進行口腔潰瘍模型的造模[12-14]，其中潰瘍自然愈合組不給藥，讓其自然愈合；其余各實驗組大鼠造模后24 h起每日給藥2次，每次0.6 mL，溶劑對照組噴15%乙醇溶液；陽性對照組噴金喉??；藥物組噴艾納香口腔護理液低(0.6 mg·mL-1，指艾粉的質量濃度，下同)、中(1.2 mg·mL-1)、高(2.4 mg·mL-1)3個濃度，每組隨機取3只大鼠進行病理切片觀察，再取8只進行愈合時間觀察，余下8只進行相關因子的檢測。

2.2 口腔潰瘍動物模型的建立

本研究主要采用改良后的陳謙明法構建口腔潰瘍動物模型，該方法能更好地觀察動物的一般形態、潰瘍面積及愈合時間[13]。經腹腔注射10%水合氯醛(3 mL·kg-1)，用于麻醉SD大鼠。取其仰臥位固定于手術臺，用止血鉗撐開上下頜，用平齒鑷拉出左右兩側頰囊，再用5號皮試針將0.25 mL配制好的10 mmol·L-1甲基紫精溶液頭緩慢均勻地扇形注射至兩側頰囊于黏膜下層約0.8 cm處，并用預制直徑為5 mm、溫度為100 ℃鐵釘在注射處觸燙3 s。手電觀察即可見該處有約5 mm的白色損害；24 h肉眼觀察頰囊處有直徑約為5 mm的潰瘍形成，表面有黃色假膜覆蓋，周圍組織充血水腫，并有炎性分泌物滲出，大鼠口腔內唾液分泌量增加。

2.3 潰瘍組織病理變化的觀察

各組隨機取3只SD大鼠，正常組不做處理，潰瘍自然愈合組在造模后24 h取樣，觀察組織形成潰瘍的形態；其余各實驗組大鼠造模后24 h起每日給藥2次，每次0.6 mL，溶劑對照組噴15%乙醇溶液；陽性對照組噴金喉??；藥物組噴艾納香口腔護理液低、中、高3個濃度，在肉眼觀察愈合后處死，各組在頰囊黏膜潰瘍處切取5 mm×3 mm達黏膜下層約1 mm厚的組織，用無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗后置于4%多聚甲醛中固定，24 h后取出標本進行石蠟包埋，并采用HE染色制作病理組織切片并在光鏡下觀察分析。

2.4 潰瘍愈合時間觀察

從余下各組中再隨機抽取8只SD大鼠，進行愈合時間觀察。在肉眼觀察潰瘍愈合后處死，并在頰部黏膜潰瘍處切取5 mm×3 mm達黏膜下層約1 mm厚的組織，用無菌0.9%氯化鈉溶液反復沖洗后置于4%多聚甲醛中固定，24 h后取出標本進行石蠟包埋，并對照各組HE染色病理組織切片圖分析，進一步判斷其是否愈合，若病理學顯示上皮細胞基本恢復完整、無炎性細胞浸潤、形態與正常組相似即為愈合，否則記為未愈合。

2.5 潰瘍組織中NO、NOS、MDA及SOD的含量測定

每組剩余的8只實驗動物，重復2.2造模的方法，分別在給藥第2、4天的相同時間點進行取樣，每次隨機抽取4只，在頰囊黏膜潰瘍處切取5 mm×3 mm達黏膜下層約1 mm 厚的組織，用4 ℃的無菌0.9%氯化鈉溶液漂洗，除去血液，用濾紙拭干后稱重后將組織剪碎，置于勻漿器中并加入9倍組織質量的0.9%氯化鈉溶液，研磨成10%的組織勻漿，隨后將勻漿液倒入離心管中，以3000 r·min-1的速度離心10 min，吸取上清液備用。按試劑盒說明書操作步驟測定各組樣品的吸光度值后，再按試劑盒說明書中的公式計算組織中NO、NOS、MDA及SOD的含量。

3 結果

3.1 潰瘍組織觀察

如圖1所示，建模前大鼠的活動正常，體重日益增加，反應靈活，頰囊處黏膜光滑紅潤(見圖1A)；采用改良陳謙明法建模后，大鼠攝食量及飲水量減少，活動量減少，體重減輕，唇邊出現流口水現象，且大便稀疏。對大鼠頰囊形成的潰瘍面進行觀察，發現有凹凸不平的橢圓形黃白色假膜覆蓋，組織充血紅腫，直徑約為5～6 mm(見圖1B)；肉眼觀察到的愈合組潰瘍面基本愈合，無紅腫糜爛現象，與正常組織形態相似(見圖1C)；在顯微鏡下觀察到，正常組織上皮細胞結構完整，成纖維細胞完整，細胞核明顯(見圖1D)；潰瘍組織可見上皮細胞脫落溶解，有大量的炎性細胞浸潤，表面覆蓋壞死組織(見圖1E)；愈合組的上皮細胞結構逐漸恢復完整，炎性細胞數量減少，與正常組的顯微形態相似。

圖1 各組別動物黏膜組織及病理學切片圖(HE，×200)

3.2 愈合時間的統計

注：與潰瘍自然愈合組比較，*P<0.05；與15%乙醇溶劑對照組比較，#P<0.05。圖2 各組大鼠潰瘍平均愈合時間(n=8)

根據分組情況，各大鼠口腔黏膜潰瘍的愈合時間統計見圖2。潰瘍自然愈合組在第8天的時候開始出現愈合，第11天的時候痊愈，平均愈合天數為9.63 d；15%乙醇溶劑對照組同樣在第8天的時候開始出現愈合，第11天的時候痊愈，平均愈合天數為9.25 d；金喉健噴霧劑陽性對照組在第4天的時候開始出現愈合，第7天的時候痊愈，平均愈合天數為5.50 d；艾納香口腔護理液低、中、高3個劑量組在觀察后的第4天開始出現愈合，第7天時痊愈，平均愈合天數分別為5.88、5.25、5.00 d。金喉健陽性對照組及艾納香口腔護理液低、中、高組的潰瘍平均愈合時間均比潰瘍自然愈合組和15%乙醇溶劑對照組短(P<0.05)；艾納香口腔護理液低、中、高組之間的愈合時間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

3.3 第2、4天取樣的各組樣品組織中NO、NOS、MDA及SOD的含量比較

按照試劑盒說明對第2天不同組別樣品組織中的NO、NOS、MDA及SOD的含量進行檢測，結果發現各給藥組與潰瘍自然愈合組比較，組織中的NO、NOS及MDA含量活性顯著降低(P<0.05)，其中高濃度組的NOS含量降低明顯(P<0.01)，陽性對照組及艾納香口腔護理液低、中、高組的MDA含量降低明顯(P<0.01，P<0.001)；同時發現陽性對照組及艾納香口腔護理液低、中、高組與潰瘍自然愈合組比較，組織中的SOD的含量顯著升高(P<0.05)。與正常對照組比較，陽性對照組及艾納香口腔護理液低、中、高濃度組織中的NO、NOS、MDA及SOD含量則無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 第2天各組樣品組織中NO、NOS、MDA及SOD的含量比較 /μmol·g-1

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與潰瘍自然愈合組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；下同。

按照試劑盒說明對第4天不同組別樣品組織中的NO、NOS、MDA及SOD的含量進行檢測，結果發現陽性對照組及艾納香口腔護理液低、中、高組與潰瘍自然愈合組比較，組織中的NO、NOS及MDA含量活性顯著降低(P<0.05)，其中艾納香口腔護理液低、中、高濃度組的NO含量降低明顯(P<0.01)，陽性對照組及艾納香口腔護理液中、高組的NOS含量降低明顯(P<0.01)；同時發現陽性對照組及艾納香口腔護理液低、中、高濃度組的SOD含量顯著升高(P<0.05)，其中艾納香口腔護理液高濃度組的SOD含量升高明顯(P<0.01)。與正常對照組比較，陽性對照組及艾納香口腔護理液低、中、高濃度組織中的NO、NOS、MDA及SOD含量則無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 第4天各組樣品組織中NO、NOS、MDA及SOD的含量比較 /μmol·g-1

4 討論

本文中的艾納香口腔護理液是以艾納香提取物為主要原料藥，輔以乙醇、甘油、聚氧乙烯氫化蓖麻油、A.SAP、木糖醇、食用香精等相應輔料組成[11]，為客觀地評價其療效，本文通過對該護理液的口腔潰瘍藥效學動物實驗進行研究，觀察組織病理切片的形態及不同的給藥濃度下對潰瘍的愈合時間進行統計。實驗結果表明，艾納香口護理液處理后的組別在第4天開始出現愈合，所需時間短于潰瘍自然愈合組和15%乙醇溶劑對照組(P<0.05)，其中以艾納香口腔護理液高濃度組(2.4 mg·mL-1)的愈合時間最短；艾納香口腔護理液低、中、高組之間的愈合時間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，說明艾納香口腔護理液在治療口腔潰瘍上有一定的療效。

此外，本文分別對造模給藥后的第2、4天各組織中的NO、NOS、MDA及SOD的含量變化進行了檢測。NO具有傳遞和調節介質的作用，是細胞信息傳遞過程中重要的調節因子，它能與氧自由基作用，在機體的炎癥反應過程中引起組織細胞的損傷和增值，延遲潰瘍愈合；NOS在NO的合成過程中至關重要，在潰瘍急性期，組織中的NO和NOS與正常組比較均有所增高，隨著潰瘍逐漸愈合，NO和NOS的含量均減少，呈現出下降的趨勢，說明在潰瘍愈合的過程中炎癥反應逐漸減輕，在一定程度上反映了潰瘍愈合的效果顯著；研究發現復發性口腔潰瘍患者的SOD比正常人要低，而脂質過氧化物含量顯著升高，說明SOD的活性反映了機體清除氧自由基的能力，揭示在復發性口腔潰瘍的發病機制中大量產生的氧自由基以及SOD活性下降可能是引起組織破壞的重要環節；而MDA是脂質過氧化反應的最終產物，會導致體內SOD活性進一步降低，從而使潰瘍更加嚴重。因此測定SOD和MDA的含量變化，可以間接地反映出氧自由基在體內的生成和清除情況，以及對組織損傷程度在體內抗氧化防御作用的功能狀況[12]。本實驗結果表明，實驗大鼠造模成功后，NO、NOS及MDA的含量明顯升高，SOD活性明顯下降；在給藥后第2、4天，艾納香口腔護理液低、中、高組的NO、NOS及MDA的含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)。而艾納香口腔護理液組與金喉健陽性藥物組間無明顯差異，說明該艾納香口腔護理液在治療口腔潰瘍的作用上與陽性藥物組療效相似。

綜上所述，艾納香口腔護理液能有效縮短口腔潰瘍的愈合時間，對組織中的NO、NOS、SOD及MDA的含量有一定影響，在口腔潰瘍的治療上具有一定的促進作用，在0.6～2.4 mg·mL-1的濃度范圍內對治療口腔潰瘍上有一定的療效。本實驗為艾納香口腔護理液在治療口腔潰瘍療效方面的研究提供了參考，并為后期臨床應用及市場開發提供依據。

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StudyonOralMucosaUlcerPharmacodynamicsofBlumeaMouthwash

ZOU Jing1，2，3，WANGKai1，3，LIHaiyan1，2，3，CHENYan1，2，3，WUPu1，3，PANGYuxin1，3*

(1.TropicalCropsGeneticResourcesInstitute，ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofCropGeneResourcesandGermplasmEnhancementinSouthernChina，Danzhou571737，China；2.SchoolofTraditionalChineseMedicine，GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，China；3.HainanProvincialEngineeringResearchCenterforBlumeaBalsamifera，Danzhou571737，China)

Objective：To provide reference for the later clinical application of Blumea mouthwash，the effect of Blumea mouthwash in the oral mucosa ulcer pharmacodynamics was investigated.Methods：Oral ulcer model of SD rats was constructed by using the modified method of the Chen Qian Ming.The histopathological changes，the ulcer healing time and the influence about the content and activation activity of malondialdehyde(MDA)，nitric oxide(NO)，nitric oxide synthase(NOS)and superoxide dismutase(SOD)in oral ulcer tissues of Blumea mouthwash were evaluated.Results：The healing time of Blumea mouthwash(low，medium，high)group wasshorter than that of the control group，while there wasno significant difference between the mouthwash group and the positive drug group.After administration of the first 2，4 days，the content of NO、NOS、MDA of Blumea mouthwash(low，medium，high)group significantly decreased relative to the ulcer group(P<0.05).The content of SOD significantly increased(P<0.05).And compared with normal and positive drug group，there is no statistical significance(P> 0.05).Conclusion：The experimental results suggest that Blumea mouthwash could shorten the ulcer healing time effectively，and is beneficial for the healing of ulcer.

Blumea mouthwash；healing time；NO；NOS；MDA；SOD

2016-02-23)

國家自然科學基金(81374065)；貴州省黔科合重大專項(2013-6011)

*

龐玉新，博士，副研究員，研究方向：南藥資源研究與開發，Tel：(0898)23300268，E-mail：blumeachina@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.012