不同產地瑪卡遺傳多樣性的ISSR分析

譚曉蕾，易帆，譚芳，彭勇

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193)

·基礎研究·

不同產地瑪卡遺傳多樣性的ISSR分析

譚曉蕾，易帆，譚芳，彭勇*

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的：從DNA 分子水平分析國內外5個不同產地瑪卡的遺傳多樣性，探索其相互之間的親緣關系。方法：采用簡單重復序列區間(ISSR)分子標記技術對11份不同產地瑪卡進行聚類分析。從20條ISSR引物中篩選出8條進行PCR擴增，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增結果進行遺傳參數統計分析，用NTSYS軟件UPGMA 法進行親緣關系聚類分析，構建聚類圖。結果：8條引物共獲得51條清晰可辨條帶，其中多態性條帶22條，平均多態性比率為43.1%。11份瑪卡的相似系數在：0.627 5～0.960 8。聚類結果顯示，國產與秘魯原產瑪卡明顯被分為兩大類。在國產9個樣品中，云南、西藏、青海聚為一支，新疆產瑪卡單獨聚成一支。結論：ISSR標記可以區別秘魯原產與引種的瑪卡樣品，然而國產瑪卡整體遺傳變異小，遺傳穩定性強。

瑪卡；ISSR；遺傳多樣性；親緣關系

瑪卡LepidiummeyeniiWalp.是原產于秘魯安第斯山脈(海拔3500 m以上)的珍稀高山藥食兩用植物，屬十字花科獨行菜屬，除含有多種營養成分外，還含有瑪卡生物堿、芥子油苷及其衍生物、甾醇等多種次生代謝活性成分[1-3]。研究表明瑪卡具有抗疲勞[4-5]、改善性功能[6]、調節內分泌、增強免疫力、抗氧化[7]的作用，并對骨質疏松[8]、抑郁癥等有很好的治療效果[9-10]，有秘魯人參、秘魯國寶等美譽。2001年《國外醫藥—植物藥分冊》首次介紹了來自南美洲的瑪卡[11]。2002 年瑪卡在云南會澤首次引種成功，此后短短十幾年間發展迅速，相繼在我國云南、新疆、青海等省(區)引種成功，在中國引起廣泛關注，并形成一定規模，成為高海拔山區發展經濟新的增長點。但是隨著栽培地區增多，藥材質量也相應成為值得社會正視的問題。

近年來，分子標記技術已經廣泛運用于藥物基因組DNA的分析之中，主要手段有ISSR、RAPD、RFLP、AFLP等。ISSR分子標記技術(Inter Simple Sequence Repeat，簡單重復間隔序列)不需要知道基因組序列即可設計引物并進行擴增，具有操作簡單、模板需要量少、多態性豐富、結果記錄方便、實驗成本低、操作簡單等優點，現已在遺傳多樣性、系統進化與物種鑒定等多個研究領域得到廣泛應用[12-13]，在芍藥[14]、金錢草[15]、狼毒[16]、丹參[17]、蘿卜[18]等中藥材上已有成功應用和報道。種質資源是影響藥材產量和質量的一個重要因素，由于用傳統的形態學方法很難將不同產地的瑪卡嚴格地區分鑒別開，而有關用分子標記分析不同產地瑪卡遺傳關系的研究也未見報道。為此，筆者采用ISSR技術對國內外不同產地瑪卡的親緣關系進行分析，并對不同產地的藥材進行分子鑒別研究，為該藥材的規范引種栽培、加強資源保護和選種育種提供科學參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

用于本實驗研究的瑪卡樣本共11份，分別采自中國的云南、新疆、西藏、青海以及秘魯。經中國醫學科學院藥用植物研究所彭勇研究員鑒定為瑪卡LepidiummeyeniiWalp.的根，憑證標本保存于藥用植物親緣中心標本室，具體編號及產地信息見表1。

表1 不同產地的瑪卡樣品信息

1.2 試劑與儀器

PCR相關試劑：提取植物基因組 DNA 用十六烷基三基溴化銨(CTAB)、β-巰基乙醇購自SIGMA公司，植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。瓊脂糖(A-garose，Gene公司)。Taq DNA聚合酶、PCR緩沖液、dNTPs、超純水等(上海生工生物工程有限公司)，引物由北京博友順生物技術有限公司合成；其他試劑均為國產分析純。Marker：GeneRuler Express DNA Ladder (MBI Fermentas公司)。

主要實驗儀器：Gel Doc 2000凝膠成像系統(美國BIO-RAD公司);PTC-200 PCR儀(美國BIO-RAD公司)；TGear微型離心機(北京天根生化科技有限公司)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海醫用恒溫設備廠)；DYY-7型電泳槽、DYY-12型電源(北京六一儀器廠)。

2 方法

2.1 瑪卡總DNA的提取

取不同產地瑪卡干藥材適量，用滅菌超純水(ddH2O)將表面沖洗干凈，吸去水分，刮掉栓皮部分，切1～2 mm直徑小塊，稱取50 mg。采用北京天根生化科技有限公司植物DNA提取試劑盒提取基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性和純度，結果見圖1。

注：1～11.不同產地樣品；M.Marker DL2000；下同。圖1 不同產地瑪卡的總DNA 電泳圖譜

2.2 ISSR擴增及產物檢測

ISSR引物序列參考University of British Columbia提供的標準序列，同時參考其他相關文獻[18-20]，篩選出能產生多態、清晰且可重復條帶的引物，用于全部11個樣本分析。

ISSR反應體系(50 μL)為：上下游引物和dNTP各1.0 μL (2.5 mmol·L-1)，總DNA 4 μL，MgCl24 μL(25 mmol·L-1)，PCR buffer 5 μL(10×)，0.6 μL Ex Taq，用ddH2O補足體積。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，55～62 ℃復性45 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環；循環結束后72 ℃延伸10 min，產物置4 ℃保存。

擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后凝膠成像系統照相，記錄結果。引物S6和S7擴增結果見圖2。

圖2 引物S6和S7對11個瑪卡樣品PCR擴增電泳圖譜

2.3 數據統計分析

電泳圖譜中遷移率一致的條帶被認為具有同源性，根據ISSR擴增條帶的有無，以1和0表示。具體而言PCR擴增產物的電泳位置在凝膠的某個相同遷移率位置上有DNA條帶記為1，無DNA條帶記為0。形成ISSR的表型數據矩陣NTSYS軟件計算相似系數(DICE系數)，并且按照遺傳距離進行UPGMA聚類分析，建立樣品間的親緣關系。

3 結果與分析

通過對20條引物的多次反復篩選，選出可有效擴增的8個引物，用于全部11個種群樣本分析。篩選原則：條帶清晰可見，多態性高，重復性好。

對表1中11個不同產地瑪卡進行ISSR擴增，各引物序列及擴增結果見表2。Jaccard相似系數矩陣和聚類系統樹見表3和圖3。

ISSR擴增的DNA片段集中在170～2000 bp，8條引物共獲得51條清晰可辨條帶，其中多態性條帶22條；平均每對引物擴增出6.4條帶，2.8條具有多態性，平均多態性比率為43.1%。其中，多態性最高的為60%，低的只有16.7%。每對引物擴增的條帶數5～8條不等，平均每個引物擴增6.4條帶和2.8條多態帶。

表2 ISSR 8對引物擴增結果

注：Y=(C，T)。

表3 基于ISSR標記的瑪卡13個樣品的遺傳相似系數矩陣

圖3 基于ISSR標記的瑪卡11個樣品的UPGMA聚類分析

利用8對引物在11個瑪卡樣品中獲得51條擴增片段，在NTSYS軟件中計算樣品間的遺傳相似系數(GS值)，得到相似矩陣。遺傳相似系數越大，表明親緣關系越近，遺傳相似系數越小，表明親緣關系越遠。從Jaccard 相似系數矩陣中可知各產地瑪卡的相似系數在：0.627 5～0.960 8，變幅為0.333 3。其中4號和5、7號樣品(云南和青海)遺傳相似系數最大(0.960 8)，6號和9號(新疆)遺傳相似系數其次(0.960 8)，表明它們之間的親緣關系較近，遺傳差異性小。3號(云南)和13號(秘魯)樣品之間的遺傳相似系數最小(0.627 5)，表明這2個樣品之間的親緣關系較遠，遺傳差異性較大。整體遺傳差異與地理分布有一定關系，但整體遺傳變異小，遺傳穩定性強。

聚類樹狀圖上顯示9種不同產地瑪卡共聚為4支，第1支為8號(西藏)、1號(云南)。第2支為2號(云南)、3號(云南)、4號(云南)，5號(青海)、7號(青海)；其中4號與5號先聚為1支，而后與7號聚為1支，最后這1支與3號、2號共聚為1支。第3支為6號(新疆)、9號(新疆)。第4支為10號(秘魯)、11 號(秘魯)。結果顯示，國產與秘魯原產的瑪卡整體上聚成兩大支，9個國產瑪卡聚在1支，上述前2支即云南、西藏、青?，斂ň蹫?支，新疆產瑪卡單獨聚成1支,表明瑪卡遺傳變異與地理分布存在一定的聯系，但9個國產的樣本，地理距離相對比較近的同一產地的藥材并沒有完全聚在一起，表明瑪卡藥材遺傳變異與地理分布沒有呈現明顯的相關性，說明國內產區之間的遺傳分化不明顯。

4 討論

利用8條引物對11 個不同產地瑪卡總DNA進行ISSR 擴增，遺傳距離、遺傳相似系數等數據表明國產引種與秘魯原產的瑪卡之間的基因組DNA存在明顯的差異，產生差異的原因除了不同的明顯的地理因素之外，還可能與栽培樣品的種質來源以及國內外的栽培方法多樣有關。

同時，國產不同產地瑪卡間親緣關系較近，遺傳差異小，遺傳較為穩定，原因可能是：①云南是目前國產瑪卡種植區域最廣泛、產量最高的地區，其他地區瑪卡可能源于與云南主產區之間的相互引種，并且引種歷史不長，尚未發生變異；②瑪卡為閉花自交植物，基因流動有限[21]，農民在水肥管理、病蟲害管理以及作物輪作等方面的不規范化嚴重制約了優質瑪卡的可持續生產；③2011年5月18日衛生部發布公告，批準瑪咖粉為新資源食品，瑪卡行業進入到快速發展階段，麗江瑪卡漸已成為繼昭通天麻、文山三七之后，云南植物王國里的又一張名片，應市場需求，周邊地區如西藏、青海、四川等地也開始進行大量人工種植。目前，國產瑪卡幾乎全部來源于人工栽培，這種人工栽培馴化及定向選擇，使遺傳差異越來越小。另一方面，瑪卡遺傳穩定性強，有利于保留其優良基因，降低了選種、留種的難度，對進一步的引種栽培及推廣種植等均具有積極意義。因此，需要通過加強環境控制、規范栽培技術、完善檢測方法等措施，保證國產引種外來植物藥的質量。

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GeneticAnalysisofLepidiummeyeniiWalp.ResourcesfromDifferentHabitatsBasedonISSRMarkers

TANXiaolei，YIFan，TANFang，PENGYong*

(InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China)

Objective：To study the population genetic diversity and relationships ofLepidiummeyeniiWalp.resources from 5 different habitats according to their DNA molecule among them.Methods：Inter-simple sequence repeat (ISSR) molecular marker technique was adopted to analyze genetic diversity ofL.meyeniifrom different habitats.8 ISSR primers with good repeatability screened from 20 ISSR primers were screened out with PCR and the amplification products were examined by 1.5% agarose gel electrophoresis.Genetic parameters were analyzed statistical and population genetic cluster was assessed by using UPGMA method (NTSYS software).Results：A total of 51 bands were amplified from 8 ISSR primers，of which 22 bands were polymorphic loci.The percentage of polymorphic fragment was up to 43.1%.The genetic similarity coefficient of the 11samples was 0.627 5-0.960 8 and samples could be divided into 2 categories differencing between Peru and China.However，9 samples from China could not be distinguished from each other significantly through cluster analysis.Conclusion：The ISSR markers can be used for identification ofL.meyeniifrom Peru or China，but the genetic variation of ChineseL.meyeniiis small with strong genetic stability.

LepidiummeyeniiWalp.；ISSR；genetic diversity；genetic relationship

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.11.011

2015-12-27)

*

彭勇，研究員，研究方向：中藥資源、保健食品研發及中藥信息學研究；E-mail: ypeng@implad.ac.cn