草麻黃莖中一個黃酮苷的NMR數據歸屬及活性研究

趙巍，胡琴，馬林，秦海林*

(1.北京市藥品檢驗所 北京市保健食品化妝品檢驗中心，北京 102206；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥物研究所 天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京 100050)

·基礎研究·

草麻黃莖中一個黃酮苷的NMR數據歸屬及活性研究

趙巍1，2，胡琴1，馬林2，秦海林2*

(1.北京市藥品檢驗所 北京市保健食品化妝品檢驗中心，北京 102206；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥物研究所 天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京 100050)

目的：對化合物3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖基山柰酚進行DMSO-d6中核磁共振波譜數據歸屬并對其活性進行研究。方法：利用溶劑提取法和硅膠柱色譜法對草麻黃莖中的化學成分進行分離，得到一個黃酮糖苷類化合物；本文選用DMSO-d6為溶劑，采用一維和二維核磁共振(1D和2D NMR)技術完成了其1H-和13C-NMR化學位移的全歸屬。通過降血脂細胞模型實驗與具有較強降脂能力的陽性對照相比進行評價。結果：通過波譜分析鑒定其結構為3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖基山柰酚，該化合物對三酰甘油有明顯的抑制作用。結論：本研究獲得了分辨比較清晰的β-D-吡喃葡萄糖基和α-L-吡喃鼠李糖基的1H-NMR信號，發現該化合物與陽性對照物比較對三酰甘油有明顯的抑制作用，本文首次報道了其藥理活性。

草麻黃；3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖基山柰酚；NMR數據歸屬；DMSO-d6；降脂活性

草麻黃是中藥麻黃的基原植物之一，為麻黃科Ephedraceae麻黃屬植物草麻黃EphedrasinicaStapf的干燥草質莖，主要分布于遼寧、吉林、內蒙古、河北、山西、河南西北部及陜西等省區，有發汗、散寒、平喘、利水的功效，中醫用于治療風寒感冒、咳喘、支氣管哮喘、水腫等癥[1]。在對包括草麻黃在內的麻黃屬植物的化學成分研究方面，已報道了苯異丙胺生物堿、N-取代乙酰胺糖苷、黃酮類化合物和有機酸等多類成分[2-5]。在我們深入研究草麻黃的化學成分過程中，又得到了一個黃酮類化合物，通過波譜分析鑒定其結構為3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖基山柰酚。已有文獻報道了其以氘代甲醇為溶劑的核磁共振波譜數據，但報道的數據中存在糖單元信號分辨不清的問題[6]。因此，本文選用DMSO-d6為溶劑，測定了該化合物的1H 和13C-NMR圖譜，并采用二維核磁共振(2D NMR)技術完成了其1H和13C-NMR化學位移的全歸屬。特別是采用1D TOCSY實驗對β-D-吡喃葡萄糖基和α-L-吡喃鼠李糖基的1H-NMR信號的偶合常數進行了補充。此外，本文還采用降脂細胞模型評價了3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖基山柰酚對血脂的影響，結果表明該化合物對三酰甘油(TG)的抑制率明顯高于陽性藥物的抑制率。

1 儀器與試藥

Q-STAR型質譜儀，Bruker Avance-Ⅲ-600型核磁共振波譜儀；柱色譜硅膠(200～300目)和薄層色譜用硅膠GF254均為青島海洋化工廠產品。實驗所用試劑均為分析純。

實驗藥材購于安徽亳州藥材市場，由中國醫學科學院藥物研究所馬林副研究員鑒定為麻黃科麻黃屬植物草麻黃EphedrasinicaStapf的干燥草質莖。

對照藥物：羅格列酮(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)。HepG2細胞(美國ATCC細胞庫)。

2 方法與結果

2.1 提取與分離

取草麻黃的干燥草質莖30 kg，用80%乙醇回流提取3次，每次加熱回流時間分別為2、1、1 h；合并提取液，減壓濃縮后得到提取粗浸膏(4.2 kg)。將此粗浸膏與800 mL蒸餾水和1300 mL 80%乙醇水溶液混懸，先連續用石油醚和乙酸乙酯萃取，繼用正丁醇萃取，減壓回收溶劑后得到正丁醇萃取物(67 g)，該萃取物用200～300目硅膠柱色譜分離，用三氯甲烷-甲醇混合溶劑進行梯度洗脫(100∶0-100∶1-50∶1-25∶1-15∶1-10∶1-5∶1-3∶1-1∶1-0∶1)分離，得到不同的部分。將三氯甲烷-甲醇(5∶1-3∶1)洗脫部分，再進行硅膠柱色譜分離，三氯甲烷-甲醇系統梯度洗脫(5∶1)，得到化合物1(8 mg)。

2.2 結構鑒定

化合物1為黃色粉末，負離子模式ESIMS給出準分子離子峰m/z593.4 [M-H]-。在1H-NMR 譜中，芳香區顯示典型的苯環AA′BB′偶合系統質子共振峰δ 7.73 (2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)和6.90 (2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)以及典型的1、2、3、5四取代的苯環質子共振峰δ 7.73 (1H，d，J=1、8 Hz，H-8)和6.43 (1H，d，J=1.8 Hz，H-6)信號。結合在1H-NMR譜上沒有黃酮類化合物H-3的信號，但顯示有兩個酚羥基信號δ 12.61 (1H，s，OH-5)和10.26 (1H，s，OH-4′)，可以確定化合物1為4′、3、5、7-四氧取代的黃酮醇類化合物。在HSQC譜上，上述兩個羥基質子均沒有與任何碳信號相關，進一步確證了其為酚羥基。在1H-NMR譜上還給出兩個糖端基質子信號δ 5.23 (1H，br s，H-1″)和4.98 (1H，d，J=7.2 Hz，H-1?)，以及一個與次甲基相連的甲基質子信號δ 0.74 (3H，d，J=6.0 Hz，6″-CH3)，結合在δ 3.11～3.96共有10個質子的多重峰，可以確定化合物1含1個六碳糖和1個6-去氧六碳糖。通過1D TOCSY實驗準確確定了兩個糖的各個質子的1H-NMR共振峰，各共振峰的偶合常數見表1。因此，根據偶合常數可以明確確定一個糖為β-吡喃葡萄糖，另一個為α-吡喃鼠李糖。在13C-NMR 譜中共有27個碳信號，結合HSQC實驗，將其分類為1個羰基、8個不連氫芳香碳、16個次甲基、1個亞甲基和1個甲基；這些數據與1H-NMR數據完全對應。因此，通過HMBC實驗中H-6與C-5、C-7、C-8、C-10，H-8與C-6、C-7、C-9、C-10，H-2′/6′與C-2、C-1′、C-3′/5′、C-4′，以及H-3′/5′與C-1′、C-2′/6′、C-4′有遠程碳氫相關，可以確定化合物1的黃酮醇母核為山柰酚。特別是通過HMBC實驗中葡萄糖基的端基質子信號與C-7的遠程相關以及鼠李糖基端基質子的信號與C-3的遠程相關可以明確確定葡萄糖基與C-7相連，而鼠李糖基與C-3相連(見圖1)。在IDNOE差譜中，通過照射δH4.98的氫核，發現δH6.73(H-8)出現增益，進一步證實葡萄糖基連在7位。因此化合物1的結構確定為3-O-α-吡喃鼠李糖基-7-O-β-吡喃葡萄糖基山柰酚，其1H和13C-NMR數據歸屬見表1。

2.3 藥理活性

相關文獻表明黃酮類化合物具有降脂活性，為此采用降脂細胞模型進行研究。取0.25 mmol·L-1油酸(OA)刺激HepG2肝癌細胞，24 h后能夠導致細胞內脂質堆積，接種于96孔板中，培養條件37 ℃，5% CO2。每孔100 μL培養基，設置不含細胞的對照孔，分別加入對照物羅格列酮10-5mmol·L-1和篩選物10-5、10-6mmol·L-1，孵育24 h后測定胞內TG水平。結果顯示，篩選物能夠使胞內TG分別降低23.9%和16.2%，陽性藥能夠使TG降低14.9%。表明同一濃度和低濃度下，篩選物對TG的抑制率明顯高于陽性藥物的抑制率。

表 1 化合物1的1H (600 MHz，DMSO-d6) 和 13C (150 MHz，DMSO-d6) NMR 數據

注：A.化學結構；B.HMBC相關。圖1 化合物1的結構和關鍵的HMBC相關(H→C)

圖2 篩選物與對照物對TG的抑制率

3 討論

已有文獻報道了3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖基山柰酚以氘代甲醇為溶劑的核磁共振波譜數據，但報道的數據中存在糖單元信號分辨不清的問題。本研究選用DMSO-d6為溶劑，采用一維和二維核磁共振(1D和2D NMR)技術完成了其1H和13C-NMR化學位移的全歸屬，并獲得了分辨比較清晰的β-D-吡喃葡萄糖基和α-L-吡喃鼠李糖基的1H-NMR信號。此外，發現該化合物與陽性對照物比較，對TG有明顯的抑制作用，本文首次報道了其藥理活性，上述研究對于麻黃植物的基礎研究具有積極意義。

[1] 肖培根.新編中藥志：第三卷[M].北京：化學工業出版社，2001：297.

[2] 丁麗麗，施松善，崔健，等. 麻黃化學成分與藥理作用研究進展[J].中國中藥雜志,2006,31(20):1661-1664.

[3] Zhao W，Deng A J，Du G H，et al.Chemical Constituents of the Stems ofEphedraSinica[J].J Asian Nat Prod Res，2009，11(2)：168-171.

[4] Zhang D，Deng A J，Ma L，et al.N-Substituted Acetamide Glycosides from the Stems ofEphedrasinica[J].Phytochem Lett，2015，12：320-327.

[5] Zhang D，Deng A J，Ma L，et al.Phenylpropanoids from the stems ofEphedrasinica[J].J Asian Nat Prod Res，2015，18(3):260-267.

[6] Chen Y H，Chang F R，Lin Y J，et al.Identification of phenolic antioxidants from Sword Brake fern (Pteris ensiformis Burm.)[J].Food Chem，2007，105(1)：48-56.

AssignmentofNMRDataofaFlavonolGlycosidefromEphedrasinicaandActivityStudy

ZHAOWei1，2，HUQin1，MALin2，QINHailin2*

(1.BeijingInstituteforDrugControl，BeijingCenterforHealthandCosmeticsControl，Beijing102206，China；2.StateKeyLaboratoryofBioactiveSubstanceandFunctionofNaturalMedicines，InstituteofMateriaMedica，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100050，China)

Objective：To obtain clear nuclear magnetic spectrum signals of 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranosylkaempferol and study its activity.Methods：One glycoside of flavonoid was isolated from the stems ofEphedrasinicaby solvent extraction and column chromatographies over silica gel.Results：The structure of this compound was elucidated to be 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranosylkaempferol，and the full assignment of the NMR data in DMSO-d6was accomplished through 1D and 2D NMR techniques.Conclusion：The compound is found to have hypolipidemic activity for the first time.

Ephedrasinica；3-O-α-L-rhamnopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranosylkaempferol；structure identification；DMSO-d6；hypolipidemic activity

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.11.012

2015-10-16)

*

秦海林，研究員，研究方向：藥物化學；E-mail：qinhailin@imm.ac.cn