文冠果葉抑制人肝癌細胞HepG2增殖和抗氧化活性部位的篩選△

張嚴磊，施歡賢，雷莉妍，宋忠興，唐志書

(陜西中醫藥大學 陜西省中藥資源產業化協同創新中心 陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712083)

·基礎研究·

文冠果葉抑制人肝癌細胞HepG2增殖和抗氧化活性部位的篩選△

張嚴磊，施歡賢，雷莉妍，宋忠興，唐志書*

(陜西中醫藥大學 陜西省中藥資源產業化協同創新中心 陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712083)

目的：研究文冠果葉不同萃取物的抗氧化及抗肝癌活性。方法：分別用水、30%乙醇水溶液、50%乙醇水溶液、70%乙醇水溶液及95%乙醇水溶液萃取文冠果葉，得到5個不同的提取部位A、B、C、D、E，采用MTT法篩選對人肝癌細胞HepG2增殖抑制作用的活性部位；抗氧化活性部位通過DPPH·清除試驗篩選。結果：A、B、C、D、E 5個部位皆有一定的抗腫瘤活性和抗氧化活性，其中抗肝癌活性最強的是部位D，樣品質量濃度為2.5 mg·mL-1時，部位D對人肝癌細胞HepG2增殖抑制率為74.27%；抗氧化活性最強的是部位E，當質量濃度為0.2 mg·mL-1時，其對自由基DPPH·清除率高達85.78%。結論：文冠果葉具有對人體有益的功效，適合開發為保健茶、化妝品等。

文冠果葉；抗氧化；抗肝癌活性

文冠果XanthocerassorbifoliaBunge是無患子科(Sapindaceae)文冠果屬(Xanthoceras)木本油料植物，一屬一種，為中國特有的民間植物[1]。文冠果原產中國西北地區，主要分布在陜西、山西、河北、內蒙古等省，具有較高的食用、藥用價值。其根莖、葉、花、果實皮等均可入藥[2]。有祛風、消腫止痛等功效，臨床上主要用于治療風濕性關節炎、風濕內熱、皮膚風熱、小兒遺尿等癥[3]。果殼提取物被證明具有改善記憶及抗老年癡呆的功效，其主要活性物質為文冠果殼苷[4]。

文冠果適應性很強，耐干旱、瘠薄，根系發達，萌蘗力強，生長快、結實早、產量高、壽命長、經濟價值大，是珍貴的觀賞兼重要的木本油料樹種。目前文冠果被國家列為木本油料作物主要樹種，其選育推廣受到國家高度重視，大力發展文冠果勢在必行。目前，全國已有文冠果栽培面積達25萬公頃[5]。文冠果葉是文冠果產業發展過程中不可忽視的一個部分，產量巨大，民間用其嫩葉代替茶飲使用，市售有文冠果葉茶相關產品。研究表明文冠果葉含有多種化學成分[6]，且民間一直相傳其具有多種養生保健作用，諸如降脂、降壓、降血糖等，但是相關藥理活性研究報道很少，幾乎沒有文獻支持。本文對文冠果葉抗氧化及抗腫瘤活性進行初步的探索研究，為文冠果資源的綜合開發利用提供科學依據與理論支持。

1 材料

1.1 藥材

新鮮的文冠果葉(楊凌普天農業科技有限公司)，通風處陰干、粉碎過4目篩備用。

1.2 細胞株

人肝癌HepG2細胞株(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)。

1.3 藥品與試劑

DMEM培養基(美國HyClone公司)；胎牛血清(浙江天航生物科技有限公司)；雙抗(北京索萊寶科技有限公司)；0.25%胰蛋白酶(美國HyClone公司)；抗壞血酸(Vc)(成都科龍化工試劑有限公司)；1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH·)標準品(Sigma公司，純度為99%)；1.10-鄰二氮菲(一水)(成都科龍化工試劑有限公司)；95%乙醇、無水乙醇、去離子水等試劑及溶劑均為分析純。

1.4 儀器

UV-2600紫外分光光度計(日本島津)；Zirbus Technology LTD-Vaco真空冷凍干燥機(香港嘉盛科技有限公司)；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司)；KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 方法

2.1 樣品制備

取新鮮的文冠果葉1000 g，陰干、粉碎后留用；分別加入3倍量的蒸餾水，30%、50%、70%及95%的乙醇水溶液，加熱回流3次，每次3 h，合并提取液，提取液濃縮后冷凍干燥得不同的樣品活性部位A、B、C、D、E備用。

2.2 抗肝癌活性部位篩選

2.2.1 HepG2細胞的培養 將HepG2細胞置于25 mL塑料培養瓶中，加入完全高糖DMEM培養基(含10%胎牛血清，100 U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)，置于37 ℃含5% CO2的恒溫培養箱內。待細胞生長至90%匯合時，用0.25%的胰酶消化傳代，3 d傳代1次。

2.2.2 MTT法檢測細胞相對存活率 HepG2細胞以1×104個/孔的密度接種于96孔板中，培養12 h使細胞充分貼壁。棄去培養基，分別加入不同濃度的文冠果葉水提部位、30%乙醇水提取部位、50%乙醇水提取部位、70%乙醇水提取部位及95%乙醇水提取部位。在細胞培養結束前4 h，每孔加入15 μL的MTT。培養結束后，吸去培養基，每孔加入150 μL的DMSO，37 ℃振蕩10 min，用多功能酶標儀檢測450 nm處的吸光度值。

2.3 抗氧化活性部位篩選

2.3.1 DPPH·標準溶液的配制 精密稱取DPPH·標準品12 mg，用甲醇溶解并定容至250 mL，低溫避光保存，備用。臨用前用甲醇稀釋2倍測量其吸光度。

2.3.2 Vc及樣品的溶液制備 分別量取Vc和樣品25 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶。分別精密量取上述溶液適量，依次用甲醇稀釋至質量濃度分別為0.01、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg·mL-1的樣品溶液。

2.3.3 實驗方法 取2 mL的DPPH·標準液與2 mL甲醇溶液混勻，常溫避光反應15 min，于517 nm處測量吸光度(A空白)，用各濃度樣品溶液代替甲醇測量其吸光度(A樣)，陽性對照參照樣品方法。

DPPH·清除率(%)=(A空白-A樣)/A空白×100%

(1)

3 結果

3.1 文冠果葉不同提取部位對人肝癌細胞HepG2增殖的抑制作用篩選結果

由圖1可以可知，A、B、C、D、E 5個部位皆有一定的抑制人肝癌細胞HepG2增殖的活性，其中C、D、E即50%、70%和95%乙醇水提部位有較強的活性。當樣品質量濃度大于1 mg·mL-1時，部位C、D、E的活性明顯，且與質量濃度之間呈良好的量效關系；當樣品質量濃度為2.5 mg·mL-1時，部位C、D和E的細胞增殖抑制率分別為69.57%、74.27%和64.5%，部位D是抑制人肝癌細胞HepG2增殖最強的部位。

注：A.水提部位；B.30%乙醇水提部位；C.50%乙醇水提部位；D.70%乙醇水提部位；*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。圖1 文冠果葉各活性部位對人肝癌細胞HepG2存活率的影響

3.2 文冠果葉不同提取部位抗氧化活性篩選結果

由圖2可知，來源于文冠果葉的部位A、B、C、D、E，對DPPH·自由基均有一定的清除活性，其中部位E清除DPPH·自由基活性最強，在質量濃度為0.2 mg·mL-1時對DPPH·自由基清除率可達85.78%，確定部位E為文冠果葉抗氧化活性最強部位。

A.水提取部位；B.30%乙醇提取部位；C.50%乙醇提取部位；D.70%乙醇提取部位；E.95%乙醇提取部位。圖2 文冠果葉各活性部位清除DPPH·的活性

4 結論

文冠果葉不同提取部位A、B、C、D、E皆有一定的抑制人肝癌細胞HepG2增殖的活性和抗氧化活性，其中抗肝癌活性最強的是部位D，樣品濃度為2.5 mg·mL-1時，部位D對人肝癌細胞HepG2增殖抑制率為74.27%；抗氧化活性最強的是部位E，當濃度0.2 mg·mL-1時，其對自由基DPPH·清除率高達85.78%。本研究結果為文冠果資源的綜合開發和利用提供了一定的科學依據與理論支持。

[1] 周榮漢.中藥資源學[M].北京：中國醫藥科技出版社，1993：331-339.

[2] 商輝，孫妍.文冠果的化學成分和藥理作用研究進展[J].中國藥房，2015，26(30)：4316-4320.

[3] 王穎，姜生，孟大利，等.文冠果的化學成分與生物活性研究進展[J].現代藥物與臨床，2011，26(4)：269-273.

[4] 遲天燕，王力華，紀雪飛，等.文冠果殼苷對側腦室注射Aβ1-42 致小鼠學習記憶障礙的改善作用[J].中國醫科大學學報，2009，38 (10)：734-736.

[5] 申登峰.甘肅省文冠果產業發展分析[J].草業科學，2010，27(5)：157-160.

[6] 馬養民，王佩.文冠果葉化學成分的研究[J].中成藥，2010，32(10)：1750-1753.

ScreeningofInhibitionofProliferationofHumanHepatocellularCarcinomaCellLineHepG2andAntioxidantActivityPartsofXanthocerassorbifoliaLeaf

ZHANGYanlei，SHIHuanxian，LEILiyan，SONGZhongxing，TANGZhishu*

(ShanxiUniversityofChineseMedicine/ShanxiCollaborativeInnovationCenterofIndustrializationofTraditionalChineseMedicineResources；ShanxiKeyLaboratoryofNewDrugsandBioactiveConstituentsofTraditionalChineseMedicine,Xianyang712083，China)

Objective：To study the antioxidant and antitumor activity of different extracts ofXanthocerassorbifolialeaves.Methods：Water，30%，50%，70%，and 95% ethanol aqueous were used to extract leaves ofX.sorbifolia，and five different fractions A，B，C，D and E were obtained，MTT method was used to screen the antitumor part on the proliferation of human hepatoma cell line HepG2；antioxidant parts was screed by DPPH radical-scavenging ration.Results：Five different fractions all showed certain antitumor and antioxidant activity，part D with the strongest anti-tumor activity，when the sample concentration was 2.5 mg·mL-1，its inhibition rate could up to 74.27%；the strongest antioxidant activity part was E.When the concentration was 0.2 mg·mL-1，the free radical DPPH radical scavenging rate was as high as 85.78%.Conclusion：The leaf ofX.sorbifoliawith beneficial effects for human beings，is suitable to develop products as health tea and cosmetics.

Xanthocerassorbifolialeaves；antioxidant；antitumor activity

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.11.013

2016-01-07)

陜西省協同創新計劃項目(2015xt-52)；陜西省科技資源開放共享平臺項目(2015FWPT-01)

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唐志書，教授，研究方向：中藥資源化學；E-mail：tzs6565@163.com