活血復脈丸質量標準研究

劉青，賴杰仁，付輝政，王棟*

(1.江西省藥品檢驗檢測研究院，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；3.九江市中醫院，江西 九江 332000)

·中藥工業·

活血復脈丸質量標準研究

劉青1，2，賴杰仁3，付輝政1，王棟1*

(1.江西省藥品檢驗檢測研究院，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；3.九江市中醫院，江西 九江 332000)

目的：建立活血復脈丸的質量標準。方法：采用薄層色譜法鑒別活血復脈丸中丹參、三七、延胡索；采用高效液相色譜法測定丹酚酸B的含量。結果：薄層鑒別色譜中特征斑點明顯，重復性較好。丹酚酸B在0.202 0～4.040 0 μg呈良好的線性關系，丹酚酸B的平均回收率為101.4% (n=6)，RSD=0.7% (n=6)。結論：通過研究建立了活血復脈丸的質量標準。

活血復脈丸；丹酚酸B；薄層色譜法；高效液相色譜法；質量控制

活血復脈丸由丹參、三七、延胡索等八味中草藥組成，為九江市中醫院在多年治療心腦血管病臨床實踐基礎上研制而成的心腦血管科協定處方。因其臨床療效較滿意，為便于臨床使用，故進一步制成濃縮丸劑，并申請院內制劑。活血復脈丸具有活血化瘀、行氣通脈、通絡止痛的功能。臨床用于冠心病、腦動脈硬化腦梗塞、冠狀動脈介入手術(PCI)后再狹窄能防治等。為了有效地控制該產品的質量，保證安全性和有效性，本實驗采用TLC法對活血復脈丸中丹參[1-3]、三七[1，4-5]、延胡索[1，6]進行定性鑒別研究，并運用HPLC法同時測定其中丹酚酸B的量[7-8]，為該制劑的質量控制提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫LC1100高效液相色譜，四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器、安捷倫色譜工作站；電子天平(Sartoris BS110S十萬分之一天平)。

1.2 試藥

活血復脈丸(九江中醫院藥業有限公司，批號分別為20140401，20140402，20140403，20140404)；丹參對照藥材、三七對照藥材、延胡索對照藥材、丹參酮ⅡA、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、延胡索乙素、丹酚酸B(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為120923-201415，120941-201410，120928-201208，110766200528，110703-201529，110745201318，110726-201213，111562-20154)；乙腈、甲醇為色譜純；水為娃哈哈飲用純凈水；其他試劑均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

2.1 丹參薄層鑒別

取本品5 g，加乙醚10 mL，振搖，放置1 h，濾過，藥渣備用，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液[1-3]。另取丹參對照藥材同法制成對照藥材溶液。再取丹參酮ⅡA對照品，加乙酸乙酯制成質量濃度為2 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；在與對照品色譜相應位置上，顯相同的暗紅色斑點。見圖1。

注：1.陰性；2、3、4.供試品；5.對照藥材；6.對照品。圖1 丹參薄層色譜鑒別

2.2 三七薄層色譜鑒別

取2.1項下備用藥渣，揮干，加甲醇50 mL，超聲處理30 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水50 mL使溶解，用水飽和正丁醇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次60 mL，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液[1，4-5]。另取三七對照藥材0.2 g，加甲醇20 mL，同法制成對照藥材溶液。再對照品加甲醇制成質量濃度為1 mg·mL-1的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取上述3種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點。見圖2。

注：1.陰性；2、3、4.供試品；5.對照藥材；6.對照品。圖2 三七薄層色譜鑒別

2.3 延胡索薄層色譜鑒別

取本品10 g，加甲醇50 mL，超聲處理30 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，加濃氨試液至堿性，用乙醚振搖提取3次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液[1，6]。另取延胡索對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取延胡索乙素對照品，加甲醇制成質量濃度為0.5 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取上述3種溶液各3 μL，分別點于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以環已烷-丙酮-甲醇(4.5∶1∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，置碘缸中約3 min后取出，揮盡板上吸附的碘后，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。見圖3。

注：1.陰性；2、3、4.供試品；5.對照藥材；6.對照品。圖3 延胡索薄層色譜鑒別

3 丹酚酸B的HPLC含量測定

3.1 色譜條件

YMCC18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動相：以甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶5∶1∶64)為流動相；檢測波長：286 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。在上述色譜條件下，丹酚酸B與其他組分的色譜峰分離度良好。色譜圖見圖4。

注：A.缺丹參陰性對照溶液；B.丹酚酸B對照品溶液；C.活血復脈丸供試品溶液。圖4 HPLC含量測定色譜圖

3.2 對照品溶液的制備

取丹酚酸B對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成質量濃度為0.2 mg·mL-1的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備

取本品適量，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得[1，7-8]。

3.4 線性關系考察

取對照品丹酚酸B 20.20 mg，置100 mL量瓶中，加70%甲醇使溶解并定容，搖勻，得丹酚酸B(0.189 3 mg·mL-1)的對照品溶液，分別吸取1、2、4、6、8、10、20 μL，按上述色譜條件測定峰面積。以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程：Y=506.13X+4.467 9(r=0.999 9)。丹酚酸B進樣量在0.202 0～4.040 0 μg與峰面積呈良好線性關系。

3.5 精密度試驗

精密吸取按3.2項下方法項下方法制備的對照品溶液10 μL，在上述色譜條件下連續進樣6次，測定峰面積。結果丹酚酸B峰面積的RSD為0.2% (n=6)，表明儀器精密度良好。

3.6 重復性試驗

取同一批活血復脈丸6份，每份約0.5 g，精密稱定，按3.3項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行分析測定，丹酚酸B的平均質量分數為11.814 1 mg·g-1，RSD為2.1%，表明該方法有良好的重復性。

3.7 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，測得丹酚酸B峰面積的RSD為1.4% (n=6)，說明供試品溶液在24 h內穩定。

3.8 回收率試驗

采用加樣回收法，精密稱取已知含量(丹酚酸B質量分數為11.814 1 mg·g-1)的活血復脈丸6份，每份約0.25 g，加入甲醇25 mL，超聲提取30 min，精密量取10 mL，每份精密加入含丹酚酸B 0.193 0 mg·mL-1(精密稱取丹酚酸B對照品20.60 mg，置100 mL量瓶中，加70%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得)的對照品溶液15 mL，按3.3項下方法制備供試溶液，在上述色譜條件下進行分析測定，計算回收率。結果丹酚酸B的平均回收率(n=6)為101.4%，RSD為0.7%。見表1。

表1 丹酚酸B回收率試驗結果(n=6)

3.9耐用性試驗

取本品照3.1項下方法試驗，分別用A：YMC C18(150 mm× 4.6 mm，5 μm)、B：YMC C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、C：waters C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3 種品牌的色譜柱按正文中的色譜條件對其進行測定，含量測定結果無明顯差別。

3.10 樣品測定

分別取不同批號的活血復脈丸4批，每個樣品取3份，按3.3項下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μL，在上述色譜條件下進樣分析，測定峰面積，用外標法計算出丹酚酸B的含量，測定結果見下表2。

表2 活血復脈丸中丹酚酸B的含量(n=3)

4 討論

4.1 專屬性考察

本實驗選擇的薄層色譜條件下，丹參、三七和延胡索供試品色譜與對照藥材和對照品色譜相應的位置上顯相同的顏色斑點，陰性樣品無干擾。

4.2 檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器對丹酚酸B對照品色譜峰進行光譜掃描，結果丹酚酸B在286 nm波長處有最大吸收，由于286 nm雜峰對目標峰干擾少且穩定，故選擇286 nm作為檢測波長。

4.3 提取方法的選擇

比較了甲醇加熱回流提取、甲醇超聲提取2種提取法，結果表明，超聲提取法提取效率大于加熱回流提取法。實驗過程中比較了提取時間(30、60、90 min)和甲醇濃度(30%、50%、70%、90%、100%)，結果表明，提取為30 min可將丹酚酸B完全提取，甲醇濃度為70%時，提取效率高于其他比例。

4.4 色譜條件的優化

本實驗通過摸索乙腈與甲酸水溶液、甲醇與甲酸水溶液以及甲醇、乙腈與甲酸水溶液按一定比例混合作為流動相，考察其分離度，結果以甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶5∶1∶64)為流動相，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃的色譜條件下供試品中丹酚酸B與其他共存組分峰能達到良好的分離。

本實驗建立了活血復脈丸中丹酚酸B的HPLC含量測定方法，并對方中主要藥味丹參、三七、延胡索進行了TLC定性鑒別。結果表明，所建立的方法操作簡便、結果可靠、重復性好。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010.

[2] 夏崇才，周芙瓊，顧寧.HPLC法測定冠心ⅴ號合劑中丹參酮ⅡA含量[J].亞太傳統醫藥，2015，11(1)：30-32.

[3] 汪祺，孫磊，鄭笑為，等.冠脈寧片(膠囊)現行標準中丹參薄層鑒別比較研究[J].時珍國醫國藥，2014，25(11)：2667-2669.

[4] 周迎春，趙懷清，梁寧.高效液相色譜法同時測定三七總皂苷中人參皂苷Rg1、Re、Rb1與三七皂苷R1含量[J].沈陽藥科大學學報，2003，20(1)：27-31.

[5] 王術玲.人參、三七、黃芪的薄層鑒別[J].中國藥品質量標準，2003，4(2)：48-50.

[6] 呂子明，孫武興，段緒紅.延胡索化學成分研究[J].中國中藥雜志，2012，32(7)：235-237.

[7] 任萃文，楊晶.丹參舒心膠囊質量標準研究[J].中國現代中藥，2013，6(15)：507-509.

[8] 許永，趙成.不同提取方法對丹參中丹酚酸B含量測定的影響[J].安徽醫藥，2009，13(10)：1193-179.

InvestigationonQualityStandardofHuoxueFumaiPills

LIUQing1，2，LAIJieren3，FUHuizheng1，WANGDong1*

(1.JiangxiProvincialInstituteforDrugandFoodControl，JiangxiProvincialEngineeringResearchCenterforDrugandMedicalDeviceQuality，Nanchang330029，China；2.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330004，China；3.JiujiangHaspitalofTraditionalChineseMedicine,Jiujiang332000,China)

Objective：To establish a quality standard of Huoxue Fumai Pills.Methods：SalviamiltiorrhizaBge.，Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen andCorydalisyanhusuoW.T.Wang in Huoxue Fumai Pills were identified by TLC.Salviandic acid B in Huoxue Fumai Pills was determined by HPLC.Results：Characteristic spots could be detected by TLC and the method had good reproducibility.The linear range of salviandic acid B was 0.203 6 ～ 2.850 4 μg (r=0.999 9).The average recovery rate was 101.4% and RSD was 0.7% (n=6).Conclusion：The established method can be used for the quality control of Huoxue Fumai Pills.

Huoxue Fumai Pills；salviandic acid B；TLC；HPLC；quality control

] 王棟，主任藥師，研究方向：中藥活性成分及質量標準研究；Tel：(0791)86217386；E-mail：fhzfhz620@sohu.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.11.024

2016-01-04)

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