毛蕊花糖苷在大鼠、比格犬體內的藥代動力學比較△

霍仕霞，高莉，彭曉明，李建梅，陳西敬，文彥麗，閆明*

(1.新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所 新疆維吾爾醫方劑學實驗室，新疆 烏魯木齊 830049； 2.中國藥科大學 藥物代謝與動力學研究中心，江蘇 南京 211198)

·基礎研究·

毛蕊花糖苷在大鼠、比格犬體內的藥代動力學比較△

霍仕霞1，高莉1，彭曉明1，李建梅1，陳西敬2，文彥麗2，閆明1*

(1.新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所 新疆維吾爾醫方劑學實驗室，新疆 烏魯木齊 830049； 2.中國藥科大學 藥物代謝與動力學研究中心，江蘇 南京 211198)

目的：采用LC-MS/MS法測定毛蕊花糖苷單次、多次給藥后在大鼠和比格犬血漿中的濃度，并對其在兩種動物體內的藥代動力學特征進行比較。方法：SD大鼠單次、多次灌胃給予毛蕊花糖苷40 mg·kg-1和靜脈注射10 mg·kg-1，比格犬單次、多次灌胃給予毛蕊花糖苷20 mg·kg-1和靜脈注射5 mg·kg-1后，于不同時間點采血，用DAS 2.0軟件擬合并計算藥代動力學參數。結果：毛蕊花糖苷在大鼠和比格犬體內吸收符合一級動力學，比格犬的達峰時間和最大血藥濃度是大鼠的兩倍多，比格犬吸收的速率和清除率明顯小于大鼠；表觀分布容積結果表明毛蕊花糖苷在大鼠某一臟器組織有特異性分布，在比格犬體內無特異性分布；比格犬血藥濃度-藥時曲線下面積較大鼠的高，表明毛蕊花糖苷在比格犬體內吸收程度較高，藥物滯留時間也較長。結論：毛蕊花糖苷在大鼠和比格犬體內的藥代動力學特征差異較大。

毛蕊花糖苷；大鼠；比格犬；單次給藥、多次給藥；比較

毛蕊花糖苷又名麥角甾苷、類葉升麻苷、阿克苷(化學結構式見圖1)，是苯乙醇苷類化合物之一，廣泛分布于肉蓯蓉、地黃、連翹等多種植物中。該化合物具有增強記憶及保護神經、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等藥理作用[1-4]。由于其生物活性強、毒副作用小且來源廣泛，受到國內外眾多研究者的重視。課題組前期參考相關文獻[5]采用LC-MS/MS法測定了生物樣品中毛蕊花糖苷的含量，在滿足有效給藥濃度前提下，進行了毛蕊花糖苷在大鼠體內的吸收、分布及排泄研究[6-7]，以及在比格犬體內的吸收研究[8]。本研究在此基礎上，完成了毛蕊花糖苷多次重復給藥后在大鼠、比格犬體內的吸收研究，并進行了大鼠、比格犬靜脈注射毛蕊花糖苷的研究，比較了毛蕊花糖苷在大鼠和比格犬體內吸收藥時曲線及藥代動力學(藥動學)參數的不同，考察其在嚙齒和非嚙齒類動物體內藥動學差異，為藥效評價及后期的新藥開發研究提供參考。

圖1 毛蕊花糖苷的化學結構式

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-10ADvp(日本島津公司)液相色譜系統和TSQ Quantum Access 三重四極桿串聯質譜儀，配備電噴霧離子源(ESI)源及 Xcalibur 2.0.7 數據處理系統(美國 Thermo Scientific公司)；操作軟件DAS 2.1.1；BS 221電子天平(Mettler Toledo公司)；旋轉離心濃縮儀(美國LABCONCO公司)；5430-R高速冷凍離心機(Eppendorf公司，離心半徑13.5 cm)；BCD-281E冰箱(Electrolux)，FORMA 700 SERIES低溫冰箱(Thermo SCIENTIFIC)等。

1.2 材料

清潔級SD大鼠，雌雄各半，體重180～220 g，由浙江省實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(浙)20140013；比格犬，雌雄各半，體重8～10 kg，上海新岡實驗動物場提供，合格證號：SCXK(滬)20140014。

藥品：毛蕊花糖苷，課題組自制(批號：201320322，含量大于99.0%，HPLC進行測定，外標法定量)。染料木素(內標)，含量：95%，由中國食品藥品檢定研究院提供。乙酸乙酯(分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司，批號：20140827)；甲醇(色譜純，美國Tedia公司)；乙腈(色譜純，美國Tedia公司)。

2 方法

2.1 色譜條件

BDS HYPERSIL C18色譜柱 (50 mm×2.1 mm，2.4 μm，Thermo Scientific)，柱溫：40 ℃，水相(A)：0.1%甲酸水溶液，有機相(B)：乙腈，按程序梯度洗脫(0～0.6 min，10%B；0.6～1.0 min，10%～70% B，1.00～4.00 min，70%；4.00 ～4.50，70%～10% B；4.50～6.00，10% B),流速：0.30 mL·min-1。

質譜條件：離子源為電噴霧離子化源(ESI)；電噴霧壓為3300 V；加熱毛細管溫度為350 ℃；鞘氣(N2)壓力為40 Arb，輔氣壓力(N2)為15 Arb；檢測方式為正離子檢測；掃描方式為選擇反應檢測(SRM)；用于定量分析的離子反應分別為m/z623.2→160.9(毛蕊花糖苷)和m/z269.0→133.1(染料木素)。

2.2 樣品制備

2.2.1 毛蕊花糖苷儲備液的制備 精密稱取毛蕊花糖苷適量，甲醇溶解配制成200 ng·mL-1的對照品溶液，染料木素適量，甲醇溶解稀釋制備成1.5 μg·mL-1的內標溶液，4 ℃保存備用。

2.2.2 血漿樣品的處理方法 取內標溶液30 μL，使用低溫旋轉濃縮儀揮干，加入50 μL的大鼠血漿樣品，加入400 μL的乙酸乙酯溶液，渦旋混勻10 min，16 000 r·min-1離心10 min，然后取上清液350 μL，揮干，100 μL甲醇復溶，渦旋混勻1 min，16 000 r·min-1離心10 min，取上清液10 μL以內標法進行LC-MS/MS測定。

2.3 大鼠的單劑量給藥

SD大鼠6只，♀、♂各半，體重180～220 g，禁食12 h，按40 mg·kg-1劑量灌胃給予毛蕊花糖苷。給藥前取空白血，分別于給藥后5、10、15、30、45、60、90、120、150、180、240、300 min經眼底靜脈取血，置加有肝素的Eppendorf管中，離心，取上層血漿-70 ℃保存供測試。

2.4 大鼠的多劑量給藥

SD大鼠6只，♀、♂各半，體重180～220 g，禁食12 h，按40 mg·kg-1劑量灌胃給予毛蕊花糖苷。每隔24 h給藥1次，共給藥6次。給藥前取空白血，第6次給藥后于5、10、15、30、45、60、120、180、240、300 min經眼底靜脈取血，置加有肝素的Eppendorf管中，離心，取上層血漿-70 ℃保存供測試。

2.5 大鼠靜脈注射給藥

SD大鼠6只，♀、♂各半，體重180～220 g，按10 mg·kg-1劑量靜注給予毛蕊花糖苷。給藥前取空白血，分別于給藥后不同時間點經眼底靜脈取血，置加有肝素的試管中，離心，分取血漿于離心管里，-70 ℃保存供測試。

2.6 比格犬單劑量給藥

比格犬4只，♀、♂各半，體重10～12 kg，禁食12 h，按20 mg·kg-1劑量灌胃給予毛蕊花糖苷。給藥前取空白血，分別于給藥后5、10、15、30、45、60、90、120、180、240、360、480 min經前肢靜脈取血，置加有肝素的Eppendorf管中，離心，取上層血漿-70 ℃保存供測試。

2.7 比格犬多劑量給藥

比格犬4只，♀、♂各半，體重10～12 kg，按20 mg·kg-1劑量灌胃給予毛蕊花糖苷。每隔24 h給藥1次，共給藥6次。給藥前取空白血，第6次給藥后于5、10、15、30、45、60、90、120、180、240、360、480 min經前肢靜脈取血，置加有肝素的Eppendorf管中，離心，取上層血漿-70 ℃保存供測試。

2.8 比格犬靜注給藥

比格犬4只，♀、♂各半，體重8～10 kg，按20 mg·kg-1劑量灌胃給予毛蕊花糖苷。給藥前取空白血，分別于給藥后不同時間點經前肢靜脈取血，置加有肝素的Eppendorf管中，離心，取上層血漿-70 ℃保存供測試。

2.9 數據處理

將血藥濃度-時間數據以DAS 2.1.1程序擬合，并利用統計距法計算峰濃度(Cmax)、達峰時間(Tmax)、半衰期(t1/2)、清除率(Cl)、分布容積(V/F)等藥動學參數。其中Cmax和Tmax為實測值，C-t曲線尾段相消除速率常數k為lnC-T直線回歸所得，AUC0-t值為梯形面積法計算所得，0-∞時間的曲線下面積AUC=AUC0-t+ Ct/k，Ct為實驗中最后一點的血藥濃度，k為血藥濃度尾段相消除速率常數。

3 結果

3.1 方法學考察

3.1.1 專屬性實驗(以大鼠單次給藥為例) 在本實驗條件下，毛蕊花糖苷的保留時間約為2.58 min，內標染料木素的保留時間約為2.77 min。通過對來自6只不同大鼠的空白血漿測定表明，血漿中的內源性雜質不干擾樣品測定，大鼠的空白血漿、空白血漿添加毛蕊花糖苷和內標(染料木素)及單劑量大鼠灌胃給藥(40 mg·kg-1)30 min的血漿樣品的色譜圖見圖2。

3.1.2 線性方程 以樣品和內標峰面積比As/Ais為縱坐標，質量濃度C (ng·mL-1)為橫坐標，以1/C2為權重系數進行回歸，得血漿樣品中毛蕊花糖苷的線性方程及回歸系數，結果見表1。

表1 大鼠、比格犬血漿中毛蕊花糖苷線性方程

3.1.3 定量下限 將滿足測定3～5個消除半衰期時樣品中的藥物濃度或能檢測出Cmax的1/10～1/20時的藥物濃度作為本測定方法的定量下限，經測定本方法加入質量濃度為10 ng·mL-1，大鼠、比格犬的定量下限均為10 ng·mL-1，見表2。

表2 大鼠、比格犬血漿中毛蕊花糖苷的定量下限實驗 (n=5)

3.1.4 相對回收率試驗 取Eppendorf 管若干，分為3組，每組5個，分別加入毛蕊花糖苷質量濃度為20、200、4000 ng·mL-1的對照品溶液50 μL，經真空離心濃縮儀揮干后，按2.2.2項下操作，測定結果帶入血漿標準曲線算出測定濃度，將測定濃度與加入濃度相比，算得血漿中毛蕊花糖苷的相對回收率。結果表明，各濃度的相對回收率均符合生物樣品分析要求，大鼠、比格犬相對回收率結果見表3、4。

注：A.空白血漿；B.含內標染料木素血漿；C.含毛蕊花糖苷血漿；TR.保留時間；AA.峰面積；SN.信噪比。圖2 空白大鼠血漿樣品LC-MS/MS圖譜

(%)

表4 比格犬血漿中毛蕊花糖苷測定的相對回收率試驗(n=5) (%)

3.1.5 絕對回收率試驗 取Eppendorf 管若干，分為3組，每組5個，分別加入毛蕊花糖苷質量濃度為20、200、4000 ng·mL-1的對照品溶液50 μL，經真空離心濃縮儀揮干后，按2.2.2項下操作，測定結果的峰面積與相同濃度對照品溶液直接進樣的峰面積相比，算得血漿中毛蕊花糖苷的絕對回收率。結果表明，各濃度的絕對回收率均符合生物樣品分析要求，見表5、6。

表5 大鼠血漿中毛蕊花糖苷測定方法的絕對回收率試驗 (n=5) (%)

表6 比格犬血漿中毛蕊花糖苷測定的絕對回收率試驗 (n=5) (%)

3.2 大鼠單次、多次重復給藥后的藥動學實驗結果

大鼠按40 mg·kg-1劑量單次、多次灌胃給藥后的平均血藥濃度-時間曲線見圖3、4，通過統計距所計算出得藥動學參數見表7。

圖3 大鼠單次給藥血藥濃度-時間曲線

圖4 大鼠多次給藥血藥濃度-時間曲線

參數單位單次多次AUC(0?t)mg·mL-1·min-12139±4032027±794AUC(0?∞)mg·mL-1·min-12239±3892118±769MRT(0?t)min8174±4007879±1014MRT(0?∞)min9652±7939573±2220t1/2min6679±12107365±1725Tmaxmin1750±10371750±987ClL·min-1·kg-1183±030205±054V/FL·kg-117910±527722717±10451Cmaxmg·L-10313±0040349±017

3.3 比格犬單次、多次重復給藥后的藥動學實驗結果

比格犬按20 mg·kg-1劑量單次、多次灌胃給藥后的平均血藥濃度-時間曲線見圖5、6，通過統計距所計算出得藥動學參數,見表8。

圖5 比格犬單次給藥血藥濃度-時間曲線

圖6 比格犬多次給藥血藥濃度-時間曲線

參數單位單次多次AUC(0?t)mg·mL-1·min-18786±13337993±545AUC(0?∞)mg·mL-1·min-18951±13158224±514MRT(0?t)min10157±104910430±1143MRT(0?∞)min11150±124311960±1687t1/2min9327±21489985±3484Tmaxmin4125±14363375±750ClL·min-1·kg-1023±003024±002V/FL·kg-13116±11253538±1397Cmaxmg·L-10893±0060824±017

3.4 大鼠、比格犬靜脈注射給藥后的藥動學實驗結果

大鼠、比格犬分別按10 mg·kg-1、5 mg·kg-1劑量靜脈注射給藥，平均血藥濃度-時間曲線見圖7、8，通過統計距計算出得藥動學參數,見表9。

圖7 大鼠靜脈注射毛蕊花糖苷的血藥濃度-時間曲線

圖8 比格犬靜脈注射毛蕊花糖苷的血藥濃度-時間曲線

參數單位大鼠(10mg·kg-1，n=6)犬(5mg·kg-1，n=4)AUC(0?t)mg·mL-1·min-144501±691557269±8531AUC(0?∞)mg·mL-1·min-144568±691157520±8678MRT(0?t)min1436±1544758±640MRT(0-∞)min1467±1664986±760t1/2min2300±2637546±1620ClL·min-1·kg-1002±000001±000VL·kg-1077±019096±024Cmaxmg·L-140481±632 17031±231

4 討論

本實驗測定了毛蕊花糖苷單次、多次重復灌胃給藥和靜脈注射給藥后在大鼠及比格犬中的血漿藥物濃度并計算出相關的藥動學參數。大鼠以單次灌胃給予40 mg·kg-1劑量的毛蕊花糖苷為例，其峰濃度Cmax為0.313 ng·mL-1，達峰時間Tmax為17.5 min，半衰期t1/2為66.79 min，清除率Cl和分布容積V/F分別為1.83 L·min-1·kg-1和179.10 L·kg-1。比格犬以灌胃給予20 mg·kg-1劑量的毛蕊花糖苷為例，其峰濃度Cmax為0.893 ng·mL-1，達峰時間Tmax為41.25 min，半衰期t1/2為93.27 min，清除率Cl和分布容積V/F分別為0.23 L·min-1·kg-1和31.16 L·kg-1。利用SPSS軟件對單劑量給藥和多劑量給藥后毛蕊花糖苷在大鼠及比格犬體內的主要藥動學參數進行統計分析，發現各藥動學參數均不存在統計學差異，證明多劑量給藥后，毛蕊花糖苷在大鼠和比格犬體內均不存在蓄積現象。

動物的種屬不同，藥物的吸收代謝有很大的差別，犬和大鼠與人在藥物吸收代謝方面屬于中等相似。本研究分別考察了毛蕊花糖苷口服和靜脈注射給藥后在嚙齒類動物大鼠和非嚙齒類動物比格犬體內吸收的差異，口服給藥后毛蕊花糖苷在嚙齒類動物大鼠和非嚙齒類動物比格犬體內吸收雖然符合一級動力學，但藥動學參數存在很大差異，比格犬的達峰時間和最大血藥濃度是大鼠的兩倍多，犬吸收的速率和清除率明顯小于大鼠，表觀分布容積結果也可以看出藥物在大鼠血漿中分布的少，其表觀分布容積遠遠大于100，超過了體液的總容積，表明毛蕊花糖苷在大鼠某一臟器組織有特異性分布，而藥物在比格犬的血漿中分布多，其表觀分布容積只有30多，表明毛蕊花糖苷在比格犬體內能夠分布于細胞內液、細胞外液，分布較廣，無特異性分布于某個組織；比格犬血藥濃度-藥時曲線下面積較大鼠的高，表明毛蕊花糖苷口服后在比格犬體內吸收程度較高，在比格犬體內的藥物滯留時間也較大鼠長[9]；靜脈注射給予毛蕊花糖苷后，結果比格犬的達峰時間是大鼠的兩倍多，表觀分布容積及清除速率差異較小，但可能由于大鼠和比格犬生理結構上的差異，毛蕊花糖苷在比格犬體內的藥物滯留時間比大鼠長，與口服給藥結果一致。

由此我們可以看出，同一藥物在不同動物體內藥代動力學特征差異較大，藥物作用的強弱和藥效持續時間的長短也不同，這些種屬間的差異，為后期對其進行制劑研究、安全性評價及毒理代謝動力學研究提供參考，并有助于指導藥物臨床研究和應用，減少藥物的危險性[10]。

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ComparisonofPharmacokineticsafterAdministrationofActeosideinRatandBeagleDog

HUO Shixia1，GAO Li1，PENG Xiaoming1，LI Jianmei1，CHEN Xijing2，WEN Yanli2，YAN Ming1*

(1.XinjiangInstituteofTraditionalUighurMedicineXinjiangLaboratoryofUighurMedicalPrescription，Urmuqi830049，China；2.CenterofDrugMetabolismandPharmacokinetics，ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanjing211198，China)

Objective：The plasma concentration of acteoside in rats and beagle dogs were determined by LC-MS/MS，and the pharmacokinetics in rats and beagle dogs were compared.Methods：SD rat were given 40 mg·kg-1acteoside in single and multiple doses viaig，and given 10 mg·kg-1acteoside viaiv.Beagle dog were given 20 mg·kg-1acteoside in single and multiple doses viaig，and given 5 mg·kg-1acteoside viaiv.Blood samples were collected at different times after administration.The pharmacokinetics were calculated by DAS 2.0 program.Results：The character of acteoside is the first-order kinetics in rats and beagle dogs，the peak time (Tmax) and peak concentration (Cmax) of beagle dogs were higher than those of rats significantly，absorption rate and clearance of beagle dogs were significantly lower than rats’；The results of apparent volume of distribution (V/F) indicated that acteoside has specific distribution in certain organs of rats’，but not in beagle dogs.The area under concentration-time curve (AUC) of beagle dogs were higher than rats’，it showed that absorption extent and residence time of acteoside in beagle dogs were all higher than rats’.Conclusion：The pharmacokinetic characteristics of acteoside were quite differences in rats and beagle dogs.

Acteoside；rat；beagle dog；single dose；multiple doses；comparison

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.008

2016-01-14)

新疆維吾爾自治區科研機構創新發展專項資金(2015007)

*

閆明，研究員，方向：藥物分析與新藥研發；Tel：(0991)2574309，E-mail：yanming21cn@sohu.com