牛磺膽酸鈉對照品標定方法的建立

汪祺，何軼，鄭笑為，姚令文，劉燕，戴忠，馬雙成

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

·基礎研究·

牛磺膽酸鈉對照品標定方法的建立

汪祺，何軼，鄭笑為，姚令文，劉燕，戴忠*，馬雙成*

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

目的：采用多種技術手段建立牛磺膽酸鈉對照品標定技術方法。方法：采用紫外光譜、紅外光譜、核磁共振波譜(包括1H-和13C-NMR)進行結構確認；用薄層色譜法和高效液相色譜法進行純度檢查；用質量平衡法進行定量分析，并采用定量核磁技術對賦值結果進行驗證。其中首次采用熱重/差熱分析(TG/DTA)和氣相色譜-質譜(GC/MS)聯用系統對牛磺膽酸鈉原料中殘留溶劑進行快速篩查。結果：牛磺膽酸鈉原料經薄層色譜法及高效液相色譜法測定，純度達到99.16%；質量平衡法賦值結果87.9%，定量核磁共振法的驗證結果為87.9%。結論：牛磺膽酸鈉對照品原料的定性鑒別結果符合要求，定量賦值結果準確、可靠；能夠用于含量測定用對照品分發、使用。

牛磺膽酸鈉；對照品標定；定性鑒別；質量平衡法；定量核磁共振技術

牛磺膽酸鈉對照品來源為牛科動物牛BostaurusdomesticusGmelin的干燥牛膽粉進行成鹽處理形成牛磺膽酸鈉鹽。目前應用涉及標準為2015版《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)牛黃蛇膽川貝液、蛇膽川貝膠囊、蛇膽陳皮片、蛇膽陳皮膠囊等項下的鑒別或含量測定用，應用較為廣泛。由于牛磺膽酸鈉在成鹽處理過程中進行了堿化處理，加入過量鈉元素以保證成鹽完全，從而滿足定值要求，因此在對其原料進行對照品標定過程中，需采用多種技術手段進行結構確認、純度檢查，最終定量賦值。

1 儀器、試劑與供試品

1.1 儀器

Waters 2695-2996 PDA系統；薄層色譜自動點樣儀(卡瑪公司)；庫倫水分測定儀(METTLER公司)；Agilent 6410B液相色譜系統串聯6410 Triple Quad四級桿質譜儀；Agilent 7890氣相色譜儀；Nicolet iN10MX紅外光譜儀(Thermo公司)；Bruker AV-Ⅲ-500核磁共振波譜儀(500Hz)；X-5顯微熔點儀；NETZSCH STA4493F3 熱重分析儀(天平靈敏度：0.1 μg，溫度范圍：室溫～2000 ℃)。氣質聯用系統：氣相系統為Agilent Technologies 7890B-GC system；質譜系統為Agilent Technologies 7000C GC/MS Triple Quad。

1.2 試劑與供試品

高效液相色譜中采用的乙腈和甲醇均為HPLC級(fisher公司)，水采用Millipore純化水系統制備，磷酸二氫鉀、磷酸均為分析純，薄層色譜應用中的正丁醇、冰醋酸、異丙醇、甲醇均為分析純。供試品為待標化的牛磺膽酸鈉對照品原料，來源為牛科動物牛BostaurusdomesticusGmelin的干燥牛膽粉。對照品為牛磺膽酸鈉對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110815-201309，純度87.8%；批號：110815-201308，純度88.9%)。

2 方法與結果

2.1 純度檢查

2.1.1 薄層色譜法 采用薄層色譜法將待標定樣品與對照品進行比對[1]，通過主斑點比移值(Rf)、主斑點顏色及深淺、雜質斑點分布等情況可直觀快速地對待標定原料純度進行初步考察，10%硫酸乙醇顯色后，可見光及UV 366 nm下檢視。結果見圖1。由圖1可知，兩個展開系統下，待標原料與對照品Rf值一致，主斑點明確，未見明顯雜質斑點。

注：A.展開劑：異丙醇-冰醋酸-水(9∶4∶3)；B.展開劑：正丁醇-冰醋酸-水(10∶1∶8)上層；S.110815-201308批牛磺膽酸鈉對照品(純度88.9%)。圖1 牛磺膽酸鈉薄層色譜圖

2.1.2 HPLC純度檢查 色譜柱：Agilent SB-C18

(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.4%磷酸二氫鉀(68∶32)；流速：1 mL·min-1；檢測波長：200 nm；結果見圖2。在上述條件下，進樣10 μg，樣品與溯源保留時間一致；除主峰外，可見雜質峰檢出，面積歸一化純度為99.17%；5%自身對照純度為99.16%。

圖2 牛磺膽酸鈉原料HPLC圖譜

2.1.3 溶劑殘留檢查 首先采用熱重/差熱分析(TG/DTA)和氣相色譜-質譜(GC/MS)聯用系統對牛磺膽酸鈉原料中殘留溶劑進行篩查，確定含有溶劑種類后進行定量測定。牛磺膽酸鈉對照品原料熱重曲線可見一明顯降落臺階，積分結果顯示熱重損失為14.9%，結果見圖3。氣相色譜柱設置溫度為230 ℃恒溫，熱分析儀加熱揮散出的氣體不經色譜柱分離直接進入質譜測定。TIC模式一級掃描結果見圖4。由圖3、4比較可知15～30 min時間段，質譜信號響應值呈規律性增大，與熱重曲線質量明顯改變時間段相符合。對該時間段質譜峰進行分析，結果見圖5，由一級質譜信息可看到準分子離子峰46，經與NIST08譜庫比對，初步推測牛磺膽酸鈉原料中可揮發物質為乙醇。為了進一步證實，本實驗將乙醇對照品與供試品同時進行二級質譜測定，CID能量設為20 eV，結果見圖6。由圖6可知，供試品與對照品乙醇質譜信息基本一致，可檢出準分子離子峰m/z：46.1，碎片離子m/z：31.2[CH3CH2OH-CH3]+，m/z：29.2[CH3CH2OH-OH]+，經一級、二級質譜信息可確定牛磺膽酸鈉中可揮發性成分為乙醇。在確定牛磺膽酸鈉原料含有溶劑種類的基礎上，對溶劑殘留量進行定量測定，結果含乙醇6.33%(RSD=0.68%)。

圖3 牛磺膽酸鈉熱重曲線圖

圖4 牛磺膽酸鈉可揮發物總離子流圖

注：A.牛磺膽酸鈉可揮發物質一級質譜圖；B.供試品與NIST譜庫比對圖。圖5 牛磺膽酸鈉可揮發物質譜比對圖

注：A.供試品；B.乙醇對照品。圖6 牛磺膽酸鈉可揮發物質譜確認圖

2.2 結構確認

采用紫外光譜(ultraviolet-visible spectrum，UV)、紅外光譜(infrared spectrum，IR)和核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance，NMR)對牛磺膽酸鈉原料進行結構確認，牛磺膽酸鈉結構圖見圖7。

圖7 牛磺膽酸鈉結構示意圖

測試方法及條件：UV測定，供試品采用甲醇溶解，濃度約為0.01 mg·mL-1，掃描范圍200～400 nm；IR測定采用KBr壓片法，供試品與KBr的比例約為1∶200；1H-NMR測定為120 MHz，13C-NMR測定為500 MHz，供試品采用CD3OD溶解。

2.3 定量賦值

牛磺膽酸鈉原料定值采用國際上通用的質量平衡法確定含量，同時采用定量NMR技術對質量平衡法賦值準確性進行驗證。

2.3.1 質量平衡法賦值結果 質量平衡法的計算公式為：

A=P×(100%-W-R-I)

(1)

式中：A—供試品中牛磺膽酸鈉含量(%)P—牛磺膽酸鈉原料的色譜純度(%)W—原料中的水分含量(%)R—原料中殘留溶劑含量(%)I—原料中熾灼殘渣含量(%)

在牛磺膽酸鈉原料的賦值中，原料色譜純度P為99.16%(見2.1.2)；水分結果W為1.15%(采用庫倫滴定法測定7份樣品，每份樣品約40 mg，RSD=0.38%)，殘留溶劑結果R為含乙醇6.33%(RSD=0.68%)，熾灼殘渣(《中國藥典》2015版一部附錄Ⅸ J法)I為3.82%，故采用質量平衡法的賦值結果為99.16%×(1-1.15%-6.33%-3.82%)=87.9%。

2.3.2 定量NMR法驗證結果 采用富馬酸(日本TCI公司，純度99.9%)為內標，氘代甲醇溶解待測樣品，以牛磺膽酸鈉1H譜中的δH2.99(2H，H26)信號峰與內標物1H譜中的δH6.77(2H)信號峰(見圖8)，按公式(2)計算供試品的含量，定量NMR法的測定結果為87.9%(RSD=0.52%)。

圖8 牛磺膽酸鈉定量核磁共振色譜圖

(2)

式中：W1—內標物稱樣量：C1—內標物純度(99.9%)MW1—內標物分子量(116.07)V1—內標物峰積分面積W2—供試品稱樣量MW2—供試品分子量(537.68)V2—供試品峰積分面積C2—供試品純度f—質子比系數

3 結論

本批牛磺膽酸鈉原料的結構鑒定結果(UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、MS)與其結構相符合，純度大于99%(HPLC法和TLC法)，證明該批原料可以用于牛磺膽酸鈉的含量測定。

采用質量平衡法測得的牛磺膽酸鈉原料含量為87.9%，用定量NMR法測得的結果為87.9%，二者差異較小，說明本批牛磺膽酸鈉原料賦值結果準確，該批原料可作為對照品分發，使用。

4 討論

4.1 TGA/DTA-GC-MS聯用系統

TGA/DTA-GC-MS聯用系統是一項創新技術，熱重分析法(TGA)可分析樣品在熱作用下質量的變化，缺點是無法確認丟失物，通過氣質聯用系統來分析熱重實驗中揮發出來的氣體給實驗室提供了一種確認方法[2-4]。目前，對照品原料在標定過程中采用TG/DTA-GC-MS聯用系統，在測定熱重損失的同時，可對揮發性成分進行快速篩查，再經氣相色譜法測定溶劑含量，庫倫水分儀測定含水量等實驗具體給值。

4.2 牛磺膽酸鈉熾灼殘渣的計算

牛磺膽酸鈉原料為牛磺膽酸經成鹽處理為其鈉鹽，牛磺膽酸鈉分子量537.68，推算鈉含量理論值為4.28%，熾灼殘渣實驗過程中，加入濃硫酸進行處理，折算硫酸鈉含量應為13.21%，熾灼殘渣實驗結果殘渣量為17.89%，扣除理論值后殘渣量為3.82%。

4.3 牛磺膽酸鈉定量NMR信號峰的選擇

定量NMR技術能夠以國際基準品為內標直接測定供試品的純度，具有專屬性強、計量溯源性等優勢，近年來已被嘗試用于對照品的標化中[5-9]。在牛磺膽酸鈉原料賦值過程中，采用定量NMR方法對質量平衡法進行驗證。定量峰選擇上，避免活潑氫干擾，盡量選擇信號穩定，雜質峰干擾小的26位的兩個氫質子進行定量分析，結果與質量平衡法相互吻合，保證了牛磺膽酸鈉定值準確。

[1] 林瑞超，馬雙成.中藥化學對照品應用手冊[M].北京：化學工業出版社，2012：298.

[2] 劉春波，曾曉鷹，王昆淼，等.熱分析-傅立葉紅外光譜-氣相色譜-質譜聯用技術分析果的熱分解產物[J].應用化學，2012，29(10)：1218-1220.

[3] 王燕，劉志華，劉春波，等.煙草中兩種紫羅蘭醇葡萄糖苷衍生物的分離鑒定及熱分析研究[J].分析測試學報，2012，31(1)：22-28.

[4] 朱峰，王明葵，田曉蕊.熱重分析和熱裂解氣相色譜-質譜聯用方法鑒別聚苯硫醚纖維[J].中國纖檢，2012，3(1)：56-58.

[5] WU Y，HE Y，HE W Y，et al.Application of quantitative1H-NMR for the calibration of protoberberine alkaloid reference standards[J].J Pharm Biomed Anal，2014，90：92.

[6] PAULI G F，GODECKE T，JAKI B U，et al.Quantitative1H-NMR development and potential of an analytical method：an update[J].J Nat Prod，2012，75(4)：834.

[7] HOLZGRABE U，DEUBNER R，SCHOLIMAYER C，et al.Quantitative NMR spectroscopy-applications in drug analysis[J].J Pharm Biomed Anal，2005，38(5)：806.

[8] 易進海，劉云華，陳燕，等.核磁共振波譜法測定藁本內酯對照品的含量[J].藥物分析雜志，2010，30(4)：680-682.

[9] 臧雅麗，王建農，李林，等.溶劑、內標物對牡荊素鼠李糖苷1H-NMR波譜變化的影響[J].藥物分析雜志，2010，30(1)：49-52.

EstablishmentofChemicalReferenceSubstanceofSodiumTaurocholate

WANG Qi，HE Yi，ZHENG Xiaowei，YAO Lingwen，LIU Yan，DAI Zhong*，MA Shuangcheng*

(NationalInstitutesforFoodandDrugControl，Beijing100050，China)

Objective：To establish chemical reference substance (CRS) of sodium taurocholate.Methods：The structure of the candidate material was characterized by ultraviolet-visible (UV)，infrared (IR) and nuclear magnetic resonance (NMR，including1H-NMR and13C-NMR).Its chromatographic purity was determined by thin-layer chromatographic (TLC) systems and high performance liquid chromatography (HPLC).In this study a rapid determination of the volatilizable substance in sodium taurocholate was firstly to use with a TGA/DTA-GC-MS combined system.Results：The results of qualitative identification of sodium taurocholate was 99.16%.The assigned value by mass balance method was 87.9%，in accordance with that obtained by quantitative NMR (87.9%).Conclusion：The structure and purity of the sodium taurocholate material met the requirements of CRS for assay.The accuracy of the assigned value obtained by mass balance method was accurate and reliable.Thus the sodium taurocholate material can be used for quality control.

Sodium Taurocholate；substance calibration；structural characterization；standard material analysis；mass balance method

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.009

2015-12-22)

*

戴忠，研究員，研究方向：藥物分析，Tel：(010)67095376，E-mail：daizhong@nifdc.org.cn；馬雙成，研究員，研究方向：藥物分析及藥物安全性評價，Tel：(010)67095282，E-mail：mashuangcheng@nifdc.org.cn