HPLC-PAD法同時測定復方黃柏液涂劑中9種成分的含量

王玉團，許麗麗，徐麗華

(山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101)

HPLC-PAD法同時測定復方黃柏液涂劑中9種成分的含量

王玉團*，許麗麗，徐麗華

(山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101)

目的：建立同時測定復方黃柏液涂劑中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、鹽酸黃柏堿、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸C、鹽酸小檗堿和連翹苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為Agilent extend C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.5%磷酸為流動相(梯度洗脫)，流速為1.0 mL·min-1；柱溫為25 ℃；PAD檢測器。結果：9種成分含量測定的線性關系良好，線性范圍和相關系數分別為12.37～185.55(r=0.999 9)、38.80～582.06(r=1.000 0)、15.90～238.50(r=0.999 9)、1.52～22.86(r=0.999 8)、48.26～723.87(r=1.000 0)、5.90～88.56(r=0.999 3)、6.58～98.64(r=1.000 0)、9.79～119.58(r=0.999 9)、16.91～253.71 μg·mL-1(r=0.999 9)；平均加樣回收率分別為98.63%、102.57%、101.31%、97.95%、102.59%、98.41%、97.59%、98.77%、101.31%；方法的精密度良好，RSD均小于2.0%(n=6)。結論：該方法準確，可靠，可用于復方黃柏液涂劑的質量控制。

高效液相色譜法-二級管陣列檢測器；復方黃柏液涂劑；含量測定

復方黃柏液涂劑主要由黃柏、連翹、金銀花、蒲公英和地龍五味藥組成。主要作用是清熱解毒、消腫祛腐。用于瘡瘍潰后傷口感染，屬陽證者。是臨床應用較廣泛的治療皮膚潰瘍等疾病的外用制劑。現行標準收載于2015年版《中華人民共和國藥典》一部，僅收載鹽酸小檗堿和連翹苷兩種成分的含量測定[1]。經研究發現，制劑中還含有新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、鹽酸黃柏堿、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸C等成分，以上成分均具有較強的抗菌藥理作用，特別是所含綠原酸類成分普遍認為具有很好的抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、軍團菌等細菌的作用，其抗菌機制可能與非競爭性抑制細菌體內的芳基胺乙酰轉移酶有關[2-5]。研究還發現，連翹苷抑菌作用并不是很強，而連翹酯苷則有明顯的抗炎、解熱、抗內毒素、抗菌和抗病毒等作用，故有必要對制劑中連翹酯苷A進行質量控制[6-8]。本文對復方黃柏液涂劑中9種成分進行含量測定，旨在為復方黃柏液涂劑的質量評價提供參考，有利于進一步提高復方黃柏液涂劑的質量控制水平。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695高效液相色譜儀；Waters 2448 PAD檢測器；METTLER AE240電子天平；超聲波清洗儀(蘇州富怡達公司)。

1.2 試藥

連翹苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：110821-201514，含量以93.5%計)；鹽酸小檗堿(中國食品藥品檢定研究院，批號：110713-201212，含量以86.7%計)；綠原酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-200413)；連翹酯苷A(中國食品藥品檢定研究院，批號：111810-201001，含量以94.3%計)；新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸C(成都普思生物科技有限公司，含量≥98%，批號分別為ps010603-05，ps010512-05，ps08103102，ps08110401)；鹽酸黃柏堿(四川維克奇生物科技公司，批號20100410，含量>98%)；復方黃柏液涂劑(山東漢方制藥有限公司)；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

參考相關文獻[9-11]，采用如下色譜條件，色譜柱：Agilent extend C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.5%磷酸溶液(B)，梯度洗脫，0～15 min，5%～25%A，15～70 min，25%～35%A，70～80 min，35%～45%A；流速：1 mL·min-1；柱溫：25 ℃；PAD檢測器(波長范圍190～450 nm)。在此色譜條件下各色譜峰峰形較好，與相鄰峰的分離度均大于1.5，符合含量測定要求，理論板數以新綠原酸峰計為6878。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、鹽酸黃柏堿、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸C、鹽酸小檗堿測定波長為325 nm，連翹苷測定波長為228 nm，分別進樣量10 μL，色譜圖見圖1。

注：A.混和對照品(325 nm)；B.混和對照品(228 nm)；C.供試品(325 nm)；D.供試品(228 nm)；1.新綠原酸；2.綠原酸；3.隱綠原酸；4.鹽酸黃柏堿；5.連翹酯苷A；6.異綠原酸B；7.異綠原酸C；8.鹽酸小檗堿；9.連翹苷。圖1 復方黃柏液涂劑HPLC圖

2.2 對照品溶液的制備

配制一定濃度的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、鹽酸黃柏堿、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸C、鹽酸小檗堿和連翹苷對照品甲醇儲備液，精密量取對照儲備液各1 mL，置50 mL棕色量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，制成質量濃度分別為61.85、194.02、79.05、7.62、241.29、29.52、32.88、39.86、84.57 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取本品5 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇4 mL，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)5 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.4 線性關系的考察

分別精密吸取混合對照品溶液2、5、10、15、20、30 μL，注入高效液相色譜儀測定。以對照品濃度X(μg·mL-1)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程，結果見表1。

表1 9種成分的回歸方程，相關系數和線性范圍

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液10 μL，按照2.1項下色譜條件，重復進樣6次，記錄峰面積，9種成分峰面積的RSD分別為1.2%、0.8%、0.2%、0.7%、0.6%、0.2%、1.1%、0.8%、1.0%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

精密吸取供試品溶液10 μL，按照2.1項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄峰面積，9種成分峰面積的RSD在0.2%～1.8%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

精密量取復方黃柏液涂劑6份，每份5 mL，按照2.3項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件，進行測定。結果9種成分含量的RSD在0.2%～2.1%，表明樣品的重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的復方黃柏液涂劑樣品6份(樣2，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、鹽酸黃柏堿、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸C、鹽酸小檗堿和連翹苷9種成分質量濃度分別為123、388、158、15.2、482、58.5、65.2、79.5、169 μg·mL-1)，每份2.5 mL，各精密加入混合對照品溶液5 mL，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)5 min，按照2.3項下方法制備供試品溶液，進樣10 μL，進行測定，計算平均回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果

表2(續)

2.9 樣品的含量測定

按2.3項下方法制備供試品溶液，并按照2.1項下色譜條件進行測定。9種成分的平均含量見表3。

表3 9種成分的含量測定結果 /μg·mL-1

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B和異綠原酸C在324～327 nm內有最大吸收，連翹酯苷A在328 nm附近有最大吸收，鹽酸小檗堿在264 nm附近有最大吸收，鹽酸黃柏堿在284 nm附近有最大吸收，以上8種成分均在325 nm處具有很強的吸收，與雜質能夠完全分離，為簡化實驗過程，故以上8種成分含量測定波長選擇為325 nm。連翹苷在波長325 nm處無吸收，其最大吸收波長為228 nm，與雜質能夠完全分離，故選擇228 nm作為連翹苷的含量測定波長。同時測定以上9種成分，僅需要提取兩個波長下的色譜圖就可以實現，且基線更加穩定，優于不同時間切換不同測定波長方法。

3.2 化學成分探索

在本實驗色譜條件下，在鹽酸黃柏堿和連翹酯苷A色譜峰之間，存在兩個較大的色譜峰，經進一步探索，主要來自處方中連翹，具體成分未知。將進一步進行相關實驗研究，以更好地探索復方黃柏液涂劑所含其他化學成分。

本實驗通過測定復方黃柏液涂劑中9種成分的含量，明確了制劑中有效成分并計算出其準確含量，為臨床準確、安全、合理用藥提供了參考，也有利于進一步提高藥品質量控制水平。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015.

[2] 姚俊，趙霞.復方黃柏液最新臨床應用進展[J].中國新藥雜志，2014，23(3)：308-312.

[3] 李友山，楊博華.復方黃柏液外治糖尿病足潰瘍對炎性因子及生長因子的影響[J].中國新藥雜志，2014，23(10)：1163-1166.

[4] 潘軍.RP-HPLC法同時測定復方黃柏液中鹽酸小檗堿，綠原酸和連翹苷的含量[J].齊魯藥事，2009，28(9)：524-526.

[5] 程力惠，盧麗霞.復方黃柏液的質量標準研究[J].亞熱帶植物科學，2012，41(2)：13-18

[6] 范毅，陳玲，朱杰，等.連翹葉化學成分[J].中國實驗方劑學雜志，2015，21(24)：22-25.

[7] 邰曉鵬，臧恒昌.HPLC法測定乳痛安口服液中連翹苷的含量[J].藥學研究，2015，24(12)：703-705.

[8] 邢麗紅，李文龍，瞿海斌.金銀花提取物中5種有機酸含量測定的紫外光譜法[J].藥物分析雜志，2011，31(3)：547-551.

[9] 陳芳，鄧雁如，郭利平.HPLC法同時測定金銀花及金芪降糖片中9種成分的含量[J].天津中醫藥，2014，31(3)：168-172.

[10] 陳天朝，翟來超.HPLC梯度洗脫測定黃柏中鹽酸小檗堿與鹽酸黃柏堿的含量[J].中醫研究，2011，24(4)：23-25.

[11] 王玉團，許麗麗，林曉，等.RP-HPLC法同時測定羚羊感冒膠囊中5種成分的含量[J].中國藥房，2014，25(47)：4475-4477.

SimultaneousDeterminationofNineEffectiveComponentsinFufangHuangbaiyeTujibyHPLC-PAD

WANG Yutuan*，XuLili，XuLihua

(ShandongInstituteForFoodAndDrugControl，250101，China)

Objective：To establish a method for simultaneous determination of neochlorogenic acid，chlorogenic acid，4-dicaffeoylquinic acid，phellodendrine chloride，forsythoside A，isochlorogenic acid B，isochlorogenicacidc，berberinehydrochlorideand phillyrin in Fufang Huangbaiye Tuji.Methods：HPLC method was adopted，Agilent extend C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)column was used with acetonitrile-0.5% phosphoric acid solution as the mobile phase for gradient elution.The flow rate was 1.0 mL·min-1，the column temperature was 25 ℃ and the PAD detection was used.Results：A good linearity of the above compounds was obtained with the correlation coefficients ranged from 12.37～185.55(r=0.999 9)，38.80～582.06(r=1.000 0)，15.90～238.50(r=0.999 9)，1.52～22.86(r=0.999 8)，48.26～723.87(r=1.000 0)，5.90～88.56(r=0.999 3)，6.58～98.64 μg/mL(r=1.000 0)，9.79～119.58(r=0.999 9)and 16.91～253.71 μg·mL-1(r=0.999 9)，respectively.The average recoveries were 198.63%，102.57%，101.31%，97.95%，102.59%，98.41%，97.59%，98.77% and 101.31%，respectively.The precisions of the method were good，and the RSDs were less than 2.0%(n=5).Conclusion：The method was accurate and reliable，that it could be used for control the quality of Fufang Huangbaiye Tuji.

HPLC-PAD；Fufang Huangbaiye Tuji；content determination

2016-02-18)

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王玉團，主管藥師，研究方向：中藥質量控制與研究；Tel：(0531)81216522，E-mail：wytuan@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.026