煙草抗番茄斑萎病毒基因篩選與生物信息學分析

楊金廣，樊韋華，楊柳青，丁 濤，王耀峰，宋玉川，董 昕，王鳳龍，劉曉璐*

（1.中國農業科學院煙草研究所，煙草行業煙草病蟲害監測與綜合治理重點實驗室，青島 266101；2.北京科技大學化學與生物工程學院，北京100083；3.甘肅省煙草公司慶陽市公司，甘肅 西峰745000；4.云南煙草保山香料煙有限責任公司，云南 保山 678000）

煙草抗番茄斑萎病毒基因篩選與生物信息學分析

楊金廣1，樊韋華2，楊柳青2，丁 濤2，王耀峰3，宋玉川4，董 昕2，王鳳龍1，劉曉璐2*

（1.中國農業科學院煙草研究所，煙草行業煙草病蟲害監測與綜合治理重點實驗室，青島 266101；2.北京科技大學化學與生物工程學院，北京100083；3.甘肅省煙草公司慶陽市公司，甘肅 西峰745000；4.云南煙草保山香料煙有限責任公司，云南 保山 678000）

通過同源克隆的方法在TSWV高感煙草品種NC89、TSWV耐病煙草品種中煙100中分別克隆出一個疑似抗番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus， TSWV）的基因，分別命名為NtSw-5NC89和NtSw-5zy100。序列分析表明，NtSw-5NC89長3819bp，包含1個完整的讀碼框，編碼1273個氨基酸，理論等電點和相對分子質量分別為5.64和147529.5Da；NtSw-5zy100長3165bp，包含1個完整的讀碼框，編碼1054個氨基酸，理論等電點和相對分子質量分別為6.75和122032.9Da；NtSw-5NC89和NtSw-5zy100均不含信號肽，均無明顯跨膜區，二者均含有大多數植物抗性蛋白所共有的CC-（NB-ARC）-LRR典型結構。系統進化樹分析表明，NtSw-5NC89與馬鈴薯假定晚疫病抗性蛋白同源R1A-3近源關系最近，NtSw-5zy100與煙草假定晚疫病抗性蛋白同源R1A-3同型X2近源關系最近。該結果可為煙草番茄斑萎病毒抗性研究和煙草番茄斑萎病毒的防治提供理論基礎。

煙草；番茄斑萎病毒；抗性基因；生物信息學分析

近年來，隨著農業產業結構的調整以及全球農副產品貿易的頻繁，造成眾多植物病毒及其媒介昆蟲的全球傳播和蔓延。番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）正是在這種情況下，隨其蟲媒介體薊馬（Thrip）進入我國，在我國煙草種植區猖獗危害[1]。種植抗病品種是防治番茄斑萎病最有效的防治措施。當前對TSWV抗性的研究主要集中在番茄和辣椒上，對煙草TSWV的抗性研究較少[2]。已明確有兩個抗病基因Sw-5和Sw-7對TSWV具有明顯抗性，通過轉基因技術或基因滲透（雜交）獲得的含Sw-5的植株表現出較強的抗性，但Sw-5 對TSWV6、Anwa-1、DaWA-1d和TOTAS-1d等4個株系的TSWV不表現抗性[3-5]。Sw-7可幫助番茄有效抵御TSWV6和Anwa-1株系的侵染[6]。TSWV在農作物上的暴發流行，除了病毒本身傳播介體繁多外，另一個重要的因素是TSWV可以通過基因突變和重組迅速適應并打破寄主抗性。對TSWV基因組變異特征分析表明TSWV的NSs和NP兩個蛋白突變導致寄主Tsw基因抗性喪失[7]。國內外對番茄斑萎病毒的抗性品種進行了大量研究，目前可通過小孢子原生質體融合技術，將野生煙草的抗性基因導入栽培品種使其獲得抗性，但迄今尚未培育出對番茄斑萎病毒抗性較強的烤煙品種[8]。由于對TSWV的自然抗病基因非常少，篩選工作困難，目前對煙草番茄斑萎病抗性基因的研究比較緩慢，科學家正致力于基因工程手段，將篩選得到的抗性基因經優化表達后導入易染病的栽培煙草基因組中，培育抗病品種。

本研究根據番茄中已確定為抗 TSWV基因序列，于煙草全基因組數據庫中，通過生物信息學的方法，篩選煙草基因組中疑似抗TSWV的基因，通過同源克隆的方法在 TSWV高感品種 NC89和TSWV耐病品種中煙100中克隆疑似靶基因。對所獲基因進行測序、蛋白結構和功能域預測、蛋白進化分析，推測該基因編碼蛋白在細胞中的存在位置、結構和功能以及與其他蛋白的近源關系，為煙草番茄斑萎病毒抗性研究和煙草番茄斑萎病毒的防治提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料

選用煙草品種NC89、中煙100，經田間試驗檢測NC89為TSWV高感品種，中煙100為TSWV耐病品種。

1.2生物信息學分析及引物設計

于煙草基因組數據庫 http://www.pngg.org/ tgi/press_release.html中，篩選煙草基因組中與番茄Sw-5基因同源性高的基因，經由序列比對，設計8對引物（表1），引物由上海生物工程技術公司合成。

表1　8對引物名稱及序列Table 1 Names and sequences of the eight pair of primers

1.3種植煙草提取RNA，反轉錄為cDNA

將煙草NC89、中煙100種植于溫室中，保持水分以確保種子發芽率。煙草生長繁盛時期，取葉片液氮速凍，用TIANGEN RNAprep pure Plant Kit提取RNA，invitrogenSuperScriptⅢ First-Strand反轉錄為cDNA。

1.4PCR擴增

以NC89、中煙100的cDNA為模板，表1中的引物，用phusionmix和KOD進行擴增。PCR擴增體系：取 cDNA l μL，10×buffer 5μL，10 mmoL/LdNTPs 4 μL，20 μmol/L上下游引物各l μL，TaqDNA聚合酶0.5 uL，加ddH2O至50 μL后進行擴增。PCR循環：94℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 3min 30 s，35次循環；最后72 ℃延伸l0 min。PCR產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用Promega Wizard SV Gel and PCR Cleanup System進行膠回收純化。

1.5克隆與測序

PCR產物純化后克隆到載體pEASY上，并轉化大腸桿菌Trans-T1感受態細胞。培養后，進行涂板（培養基含氨芐青霉素）檢測，每對引物對應的培養物各挑8個單克隆用rTaq進行菌落PCR陽性檢測。將陽性結果送上海生物工程技術公司進行雙向測序。

1.6蛋白功能域預測

利用 Expasy-ProtParam進行理化性質分析，ExPASy-ProtScale進行疏水性結構分析，用SignalP 4.1 Server （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測蛋白信號肽，用在線 TMHMM Serverv.2.0（http: //www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測蛋白序列跨膜區，用 NCBI-Blast進行結構域預測分析，用Predictprotein進行作用位點分析。

1.7蛋白進化分析

應用NCBI-Blast和MEGA6等軟件對所得序列進行分析。

2　結　果

2.1RNA提取

紫外分光光度計測定提取的葉片總 RNA，OD260/OD280在1.9～2.0，電泳檢測條帶清晰無拖帶，所得RNA質量很好，基本無降解。

2.2利用8對全長引物獲得的煙草抗TSWV基因的克隆

表1中第2和第7對引物對NC89 cDNA各擴增出一段4000 bp左右的片段，第3和第4對引物對中煙100 cDNA各擴增出一段4000 bp左右的片段。但菌落PCR陽性檢測中只有第2和第3對引物對應的單克隆培養物檢測出4000 bp左右的條帶。

2.3篩選所得核酸序列和推導出的氨基酸序列

獲得了煙草品種NC89的目的片段，測序結果表明，該片段全長3819 bp，包含1個完整的讀碼框，編碼1273個氨基酸（圖1）。經NCBI序列比對，該片段與Sw5-a、Sw5-b、Sw5-c、Sw5-d、Sw5-e的相似度分別為78%、78%、77%、77%、77%，相似度較高，命名此段序列為NtSw-5NC89。

獲得了煙草品種中煙100的目的片段，測序結果表明，該片段全長3165 bp，包含1個完整的讀碼框，編碼1054個氨基酸（圖2）。經NCBI序列比對，該片段與Sw5-a、Sw5-b、Sw5-c、Sw5-d、Sw5-e的相似度分別為79%、79%、78%、79%、77%，相似度較高，命名此段序列為NtSw-5zy100。

2.4篩選所得基因編碼蛋白質的結構分析

理化性質分析結果顯示，NtSw-5NC89的理論等電點和相對分子質量分別為5.64和147529.5Da，總平均疏水指數為-0.201。NtSw-5zy100的理論等電點和相對分子質量分別為6.75和122032.9 Da，總平均疏水指數為-0.141。疏水性分析結果（圖3A、B）顯示，NtSw-5NC89和NtSw-5zy100的疏水性峰值高于0的氨基酸占總氨基酸數目的比例均低于 50%，且NtSw-5NC89和NtSw-5zy100的總平均疏水指數均小于0，可以斷定二者均為親水性蛋白。蛋白跨膜區域分析結果（圖3C、D）顯示，二者均無明顯跨膜區。NtSw-5NC89和NtSw-5zy100信號肽預測結果（圖3E、F）顯示，二者均無信號肽。Predictprotein二級結構分析，預測NtSw-5NC89的α-螺旋、β折疊、卷曲結構所占比例分別為56.09%、6.36%、37.55%；預測NtSw-5zy100的α-螺旋、β折疊、卷曲結構所占比例分別為、β折疊、卷曲結構所占比例分別為51.71%、7.87%、37.55%。蛋白質結合位點預測結果（圖4A、C）顯示，NtSw-5NC89和NtSw-5zy100均含有一個DNA結合位點（DNA-binding-region）和多個可能的蛋白結合位點（protein binding region）。NCBI-Blast結構域預測（圖4B、D）顯示NtSw-5NC89和NtSw-5zy100均含有抗性蛋白卷曲螺旋（RX-CC_like）和P-loop核苷三磷酸水解酶（P-loop_NT）結構域以及核苷酸結合-臂重復蛋白（NB-ARC）結構域、亮氨酸重復（LRR）結構域，即CC-（NB-ARC）-LRR結構，NtSw-5zy100因LRR結構分布較為分散未能在圖中集中體現。

圖1　NtSw-5NC89編碼區核酸序列及其推導出的氨基酸序列（陰影部分為功能結構域）Fig. 1 Nueleotide and predicted amino acid sequence of NtSw-5NC89（the shaded part for function structure domain）

2.5系統進化樹分析通過NCBI-Blastp在線同源性比對，應用MEGA6軟件進行系統進化樹分析，結果顯示（圖5）NtSw-5NC89和 NtSw-5zy100分別位于一個大分支的兩個不同小分支上，其中NtSw-5NC89與馬鈴薯假定晚疫病抗性蛋白同源R1A-3（NCBI蛋白序列號XP_ 015168988.1）親源關系最近（100%氨基酸相似度）。NtSw-5zy100與煙草假定晚疫病抗性蛋白同源R1A-3同型X2（NCBI蛋白序列號XP_ 009777376.1）近源關系最近（84%氨基酸相似度）。所獲得的兩個基因編碼蛋白同番茄斑萎病抗性蛋白家族（抗性蛋白A、抗性蛋白B、抗性蛋白C、抗性蛋白D、抗性蛋白E，分別由Sw5-a、Sw5-b、Sw5-c、Sw5-d、Sw5-e編碼，NCBI蛋白序列號分別為AAG31013.1、AAG31014.1、 AAG31015.1、 AAG31016.1、AAG31017.1）不在一個大分支上，同源性相對較低（NtSw-5NC89與抗性蛋白A、抗性蛋白B、抗性蛋白C、抗性蛋白D、抗性蛋白E氨基酸相似度分別為58%、58%、61%、61%、61%；NtSw-5zy100與抗性蛋白A、抗性蛋白B、抗性蛋白C、抗性蛋白D、抗性蛋白E氨基酸相似度分別為64%、65%、63%、60%、61%）。

圖2　NtSw-5zy100編碼區核酸序列及其推導出的氨基酸序列（陰影部分為功能結構域）Fig. 2 Nueleotide and predicted amino acid sequence of NtSw-5zy100（the shaded part for function structure domain）

圖3　NtSw-5NC89和NtSw-5zy100的疏水性分析、跨膜區域預測和信號肽預測Fig. 3 Hydrophobicity analysis， transmembrane region prediction， and signal peptide prediction of NtSw-5NC89and NtSw-5zy100

圖4　NtSw-5NC89和NtSw-5zy100結合位點和結構域分析Fig. 4 Binding site and structure analysis of NtSw-5NC89and NtSw-5zy100

圖5　基于NtSw-5NC89和NtSw-5zy100的系統進化樹分析Fig. 5 Phylogenetic tree analysis of NtSw-5NC89and NtSw-5zy100

3　討　論

本文通過同源克隆方法在TSWV高感品種NC89和TSWV耐病品種中煙100中分別篩選出疑似抗TSWV的基因NtSw-5NC89和NtSw-5zy100。運用生物信息學的方法分析了該基因的理化性質，并對其功能進行了預測。分析表明，NtSw-5NC89和NtSw-5zy100編碼蛋白均不含信號肽、均無明顯跨膜區，這與Sw5-a和Sw5-b編碼蛋白結構相似［9］，推測此二者編碼的蛋白不是分泌性蛋白，該類蛋白不可能定位于膜上。系統進化樹分析表明，所得兩個基因編碼蛋白與假定晚疫病抗性蛋白同源型近源關系相近，而與番茄斑萎病抗性蛋白家族近源關系相對較遠，可能與基因所在物種的差異性有關，不同物種對同一植物病毒的抗性蛋白可能有各自的特異性。

對 NtSw-5NC89和 NtSw-5zy100結構域分析可看出，二者均含有RX-CC_like、P-loop_NT、NB-ARC、LRR等結構，這與Sw5-a、Sw5-b編碼的抗性蛋白A、抗性蛋白B極為相似（抗性蛋白A、抗性蛋白B中均含有CC-（NB-ARC）-LRR結構）［9］。RX-CC結構是馬鈴薯病毒X抗性蛋白（RX）或其相似蛋白的N端卷曲螺旋結構，此結構能夠與抗病性反應所必須的RanGAP2輔助因子相作用，進而產生抗病效應。P-loop結構結構含有NTP水解酶結構域，包括 GTP酶激酶（KG）類和額外鏈催化酶（Additional Strand Catalytic Enzyme， ASCE）類兩個主要的結構類，參與多種細胞內反應，在番茄斑萎病抗性蛋白A、抗性蛋白B中均能找到類似結構的激酶結構域［9］，該結構域可能在病毒抗性反應中具有重要作用。LRR結構易于形成亮氨酸拉鏈，參與蛋白質的多聚化和與其他蛋白的結合，番茄斑萎病抗性蛋白A只有一個亮氨酸拉鏈，而番茄斑萎病抗性蛋白B有兩個，通過煙草轉化試驗發現，Sw5-b對TSWV有抗性，而Sw5-a無，這可能與其結構中的亮氨酸拉鏈個數有關［9］。NtSw-5NC89的LRR結構連續分布，而NtSw-5zy100分布卻較為分散，因此在形成亮氨酸拉鏈時產生差異，這有可能是 NC89 為TSWV高感品種而中煙100為耐病品種的原因。此外，NB-ARC結構域是植物疾病抗性基因一個顯著的信號結構［10］，ARC是信號傳導途徑下游非常重要的蛋白質因子，參與眾多信號途徑。大多植物病毒抗性基因含有NBS和LRR結構域，以便與受體結合［11］，在番茄斑萎病抗性蛋白A、抗性蛋白B中也均發現該結構。CC-（NB-ARC）-LRR結構是植物抗性蛋白所包含的典型結構［12］，番茄斑萎病抗性蛋白A、抗性蛋白B以及番茄線蟲抗性基因產物Mi 和 Prf均含有此結構［9］，這些細胞內的抗性蛋白識別病原體效應蛋白進而促發一個可能使局部細胞死亡的反應。在番茄中，當TSWV入侵植株時，Sw-5顯性個體會引發一個過敏反應，導致TSWV入侵位點或入侵位點周圍的細胞快速死亡，使病毒感染不至于達到植株損傷程度，同時也避免了病毒入侵點鄰近細胞的感染，防止病毒感染擴散，植株因此表現出對TSWV的抗性［13-14］。推測NtSw-5zy100可能在煙草個體中引發一個相類似的過敏反應，從而使中煙100對TSWV產生耐受性，只出現輕微的花葉或壞死斑點，表現為不被TSWV大面積侵染，而NtSw-5NC89未能引發類似的過敏反應或過敏反應未能引起入侵點周圍細胞快速死亡，從而使NC89煙草植株受TSWV侵染后易出現壞死癥狀。

綜上可看出，NtSw-5NC89和NtSw-5zy100均含有抗性蛋白所具有的CC-（NB-ARC）-LRR典型結構，雖然在系統樹中與番茄斑萎病抗性蛋白A、抗性蛋白B相對較遠，但在結構上卻極為相似，這對其在煙草中可能具有的番茄斑萎病抗性奠定了結構基礎。番茄中Sw-5包含眾多的基因家族成員，各成員編碼蛋白除了共有的典型結構域外，也有各自特異之處，不同的同源序列可能對不同的番茄斑萎病毒有抗性［9，14］，NtSw-5NC89和 NtSw-5zy100除共有植物抗性蛋白典型結構域外，又互有差別，可能為煙草番茄斑萎病毒抗性基因家族中的一員，在煙草中負責抵抗不同亞型番茄斑萎病毒。

4　結　論

從煙草NC89和中煙100中分別獲得疑似抗番茄斑萎病毒基因 NtSw-5NC89和 NtSw-5zy100，NtSw-5NC89長 3819bp，編碼1273個氨基酸，NtSw-5zy100長3165bp，編碼1054個氨基酸。NtSw-5NC89和NtSw-5zy100均為親水蛋白，均無明顯跨膜區，均無信號肽，均含有植物抗性蛋白所共有的 CC-（NB-ARC）-LRR結構域，二者與假定晚疫病抗性蛋白同源型在系統樹中進化關系相近。NtSw-5NC89和 NtSw-5zy100來源于煙草，在煙草番茄斑萎病毒的抗性研究和防治方面有廣闊的前景和應用潛力，但對于二者的調控機理和導入煙草植株后的表達狀況，還需要進一步的試驗驗證。

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Screening and the Bioinformatics Analysis of the Nicotiana tabacum L. TSWV-Resistant Genes

YANG Jinguang1， FAN Weihua2，YANG Liuqing2， DING Tao2， WANG Yaofeng3，SONG Yuchuan4， DONG Xin2， WANG Fenglong1， LIU Xiaolu2*
（1. The Tobacco Industry， Tobacco Plant Diseases and Pests Monitoring and Comprehensive Control Key Laboratory， Tobacco Research Institute of CAAS， Qingdao 266101， China； 2. School of Chemistry and Biological Engineering， University of Science and Technology Beijing， Beijing 100083， China； 3. Gansu Tobacco Corporation Qingyang Tobacco Corporation， Xifeng 745000， Gansu，China； 4. Yunnan Tobacco Baoshan Oriental Tobacco Co.， Ltd.， Baoshan 678000， Yunnan， China）

Two putative TSWV-resistant genes， named NtSw-5NC89and NtSw-5zy100respectively， were isolated from the TSWV-high sensitive Nicotiana tabacum L. NC89 and TSWV- resistant Nicotiana tabacumL.zhongyan 100 using homology-based cloning，. Sequence analysis showed that NtSw-5NC89is 3819 bp long and contains an open reading frame which encodes a polypeptide of 1273 amino acids with the theoretical isoelectric point 5.64 and molecular mass 147529.5 Da. NtSw-5zy100is 3165 bp long and contains an open reading frame which encodes a polypeptide of 1054 amino acids with the theoretical isoelectric point6.75 and molecular mass 122032.9 Da. No signal peptide or transmembrane region was detected in NtSw-5NC89or NtSw-5zy100Both proteins contain a CC-（NBARC）-LRR typical structure which is shared by most plant resistance proteins. Phylogenetic tree analysis showed that NtSw-5NC89had the highest similarity to the Solanum tuberosum putative late blight resistance protein homolog R1A-3 and NtSw-5zy100had the highest similarity to the Nicotiana sylvestrisputative late blight resistance protein homolog R1A-3 isoform X2. Results of this study provide theoretical basis for resistance study， prevention and treatment of Nicotianatabacum L. TSWV.

Nicotiana tabacum L.； TSWV； resistance gene； bioinformatics analysis

S435.72

1007-5119（2016）04-0060-08

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.04.011

國家煙草專賣局科技創新平臺項目“煙草行業煙草病蟲害監測與綜合治理重點實驗室專項經費”（023201305）；云南省煙草公司科技項目“德宏綠色生態優質煙葉生產技術研究及應用”（2013YN37）

楊金廣（1979-），博士，副研究員，主要研究方向為分子病毒學與生物防治。E-mail：yangjinguang@caas.cn*通信作者，E-mail：xiaoluliu@ustb.edu.cn

2015-11-12

2016-03-29