煙草種質資源遺傳多樣性與群體結構分析

張銘真，邢雪霞，李曉輝，楊鐵釗，徐世曉

（河南農業大學煙草學院，鄭州 450002）

煙草種質資源遺傳多樣性與群體結構分析

張銘真，邢雪霞，李曉輝，楊鐵釗，徐世曉*

（河南農業大學煙草學院，鄭州 450002）

發掘優良基因，為改良煙草品種提供理論依據。采用ABI-3500xl遺傳分析儀對87份煙草種質材料進行多態性檢測。在87份煙草種質中，41對SSR引物共檢測出241條多態性位點，平均為5.88個位點。遺傳相似系數為0.47～0.91，PIC值為0.23～0.91，平均為0.63。群體結構分析表明，當K=2時，△K值最大，即87份煙草材料可劃分為2個類群P1和P2，P1類群又可劃分為5個亞類，P2類群可劃分為2個亞類。煙草種質資源遺傳多樣性豐富，群體結構劃分與種質類型不完全相關。

煙草；SSR熒光標記；遺傳多樣性；群體結構

煙草是我國重要經濟作物之一，目前煙草育種面臨親本匱乏，品種遺傳背景狹窄等問題［1］，亟需加強對種質資源的遺傳基礎的了解。對現有煙草種質材料進行遺傳多樣性研究，可以選擇遺傳差異較大的親本配制雜交組合，減少育種工作量，提高育種效率。同時，尋找與目標性狀相關的分子標記，可以為分子標記輔助育種奠定基礎。當前，分子標記已開始應用于作物遺傳資源及育種研究，分別被稱為分子資源鑒定和分子標記育種［2］。隨著分子生物學技術的迅猛發展，分子標記技術日趨成熟，目前常用的分子標記有RFLP、SRAP、AFLP、ISSR、SSR等。微衛星（亦稱簡單序列重復 simple sequence repeats， SSR）技術具有多態性高、數量豐富、重復性好、呈共顯性、廣泛分布于基因組等優點［3］。Bindle等［4］從Tobacco Genome Initiative公布的煙草基因組序列信息中搜索到282對SSR引物，并利用這些引物構建了煙草遺傳連鎖圖。聶瓊等［5］利用SSR和 ISSR技術分析了23份煙草種質遺傳多樣性。文軻等［6］利用SSR技術，以抗CMV的烤煙品種臺煙8號、感病品種NC82為親本，構建BC1代分離群體，篩選到一個與抗性基因相關的SSR標記，并認為臺煙8號對CMV的抗性是由多基因控制。祁建民等［7］應用ISSR技術，對煙草屬4個種30份材料進行遺傳多樣性分析，發現栽培種內的遺傳基礎相對狹窄。陳雅瓊等［8］用36對SSR引物，分析了63份烤煙和8份白肋煙種質的遺傳多樣性，也表明我國煙草栽培種間的遺傳基礎狹窄、遺傳多樣性不豐富。陳杰等［9］結合形態學標記和SSR分子標記對 69份烤煙種質資源進行遺傳多樣性評價，它們之間的遺傳距離在 0.32～7.83，遺傳相似系數在0.30～0.96。以往的研究存在研究材料的類型、數量不足、代表面較窄的問題，因此本研究征集不同類型不同來源的煙草種質材料，并基于全自動 DNA遺傳分析系統的 SSR熒光標記檢測技術，利用Genographer軟件精確定量擴增產物的片段長度，對87份煙草種質進行遺傳多樣性和群體結構研究。確定煙草種質材料間的遺傳背景差異與群體結構，為煙草優異基因的發掘、復雜性狀關聯分析以及拓展煙草育種的遺傳基礎提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

87份煙草種質資源名稱列于表1，種質資源來源于河南農業大學煙草育種實驗室和青州煙草研究所。2015年5月取苗期剛長出來的新鮮葉片至于2 mL離心管中液氮冷凍帶回河南農業大學煙草育種實驗室，從液氮中取出放置于-70 ℃超低溫冰箱中保存待用。

1.2煙草總DNA提取和SSR-PCR擴增

樣品離心管置于磨樣機上，待葉片磨碎后于液氮中迅速冷凍，用TaKaRa新型植物基因組DNA提取試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司）提取DNA。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測質量后保存于-20 ℃冰箱待用。

利用三引物法PCR（在5?端加有M13尾巴序列的特異正向引物、特異反向引物及帶有熒光標記的通用型M13引物，利用毛細管電泳技術可以同時檢測不同熒光染料標記的多個SSR位點）擴增SSR位點。所用的熒光標記引物是M13-Cy5，序列為5?-CACGACGTTGTAAAACGAC-3?，在合成SSR引物時，在每個正向引物的5?端加上M13尾巴序列，SSR引物由金唯智（蘇州）生物科技有限公司合成。正、反向引物的濃度均稀釋為10 μmol/L，-20 ℃保存備用。

SSR-PCR反應體系為10 μL，包括：2 μL基因組DNA，0.6 μL Mg2+，1 μL 10×Buffer，0.15 μL dNTP，0.1 μL rTaq酶，帶熒光標記的M13正向引物0.1 μL，正向引物和反向引物各0.05 μL，0.15 μL。PCR程序如下：94 ℃ 5 min預變性；94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；94 ℃ 30 s；退火溫度各引物不同。

1.3毛細管電泳檢測

PCR產物吸取2 μL于加有6 μL變性劑的384孔板中，95 ℃變性5 min。PCR產物用AB公司Genetic Analyzer 3500 xl儀器進行檢測。試驗結果用Genographer軟件進行數據讀取。

1.4數據分析

對Genographer軟件獲得的原始數據轉化為0，1格式，建立原始矩陣后用NTSYS-pc 2.10e［10］軟件進行后續分析。計算多態性位點百分率P（%）=（k/n）×100，其中k是多態位點數，n為所測位點總數。SSR位點的多態性信息量（PIC）按照如下公式進行計算：PIC=1-∑Pi2，公式中Pi表示第i個等位位點出現的頻率。利用 NTSYS-pc Version 2.10e中的Qualitative date模塊計算任意兩個品種間的相似系數（GS）。以Clustering程序中SHAN進行UPGMA（非加權組平均法）聚類分析，繪制聚類樹狀圖；利用Structure2.3.4［11］軟件，采用混合模型進行群體遺傳結構分析。

表1　供試材料Table 1 Nicotiana tabacum accession lines investigated in this study

2　結　果

2.1SSR引物多態性分析

從80對引物中篩選出41對多態性較好、擴增帶清晰的引物對87份煙草種質進行分析。41對引物在87份煙草種質中擴增出241條多態性條帶。各引物多態性條帶數為2～24，平均每對引物能擴增到 5.88個多態性片段。各引物的 PIC值變幅為0.23～0.91，平均為0.63（表2）。

2.2煙草種質資源聚類分析

以41對SSR引物的擴增帶型為基礎，以0，1格式表示，其中數據缺失標記為 2，用 NTSYS-pc2.10e軟件進行UPGMA法聚類分析，得出87份種質的聚類圖。各種質間遺傳相似系數范圍為0.47～0.91，其中玉水3號（25）與G70（39）相似系數最大，為0.91，說明親緣關系很近；密節多葉煙（60）與K326（9）之間的相似系數為0.47，說明這兩品種間的親緣關系較遠。在相似系數0.66處，可將87份煙草種質分成5大類。贊比亞1號（香料煙）和T.I.245各成一大類，第3類僅包括Criollo Salteno 11和B-1000，兩者間相似系數為0.69。第4大類由Virgina Gold、Ky151、丸葉、青梗、金英、密節多葉煙、紅花小黑煙、陳河金堂煙、廣雜87號、Basma Llovina、Vranjska Jaka、督葉尖干種、夏灣那13個品種組成。其他品種構成第5大類。在相似系數0.64處可將87份煙草種質分為兩大類；Virgina Gold、Ky151、丸葉、青梗、金英、密節多葉煙、陳河金堂煙、廣雜87號、Basma Llovina、Vranjska Jaka、督葉尖干種、夏灣那等13個品種為一類，剩余品種為第2類。在不同相似系數處劃分會得到不同類型，但是這兩種劃分都將烤煙類種質聚集為一大類，其中亦會參雜其他類型煙草種質。

2.3供試煙草種質群體結構分析

本研究利用全基因組41個SSR標記對87份煙草品種進行群體結構分析；假定亞群數目 K為1～10，每個K值運行5次模擬運算。隨著K值的逐漸增加，軟件輸出的后驗概率LnP（D）值呈連續上升趨勢，但LnP（D）值最明顯的變化發生在K由1到2的過程中。△K綜合考慮了LnP（D）的變化速率和方差，當K=2時，△K出現峰值（圖1a）。從上述方法判斷，本群體中 87份煙草品種被分成兩個類群，P1和P2（圖1）。P1類群包含50個煙草品系，在P1類群中，群體結構分析發現，隨著K值的逐漸增加，后驗概率LnP（D）值呈上升趨勢，當K由4 到5時，LnP（D）值變化最為明顯。當K=5時，△K出現了峰值（圖1b）。因此P1類群中檢測到5個亞類群。在P2類群中，群體結構分析發現，隨著K值的逐漸增加，后驗概率LnP（D）值逐漸上升，當K 由1到2時，LnP（D）值變化最明顯，當K=2時，△K出現了峰值（圖1c）。因此P2類群中檢測到兩個亞類群。煙草87個品種的群體結構示意圖如圖2。

3　討　論

拓寬煙草遺傳基礎，發掘優異基因，改良煙草品種是目前我國煙草育種的首要任務，而缺乏對種質資源遺傳特點的了解是完成這一任務的最大障礙；目前許多研究者利用各種分子標記技術探討了煙草資源的遺傳多樣性與親緣關系。Moon等［12］利用46對SSR引物對54份煙草屬材料進行聚類分析，得到的結果與基于形態細胞學的觀察分類結果一致。王志德等［13］用43個RAPD引物PCR擴增出214個DNA片段，將24個煙草種質分為6大類群，并表明其有高度的遺傳多樣性。梁景霞等［14］用18個ISSR分子標記引物，對96份煙草種質進行PCR擴增，共獲得314條穩定條帶，并用Nei-Li相似系數法計算其遺傳相似系數在0.28～0.97，遺傳多樣性豐富。Patrizia Bogani等［15］利用15對RAPD引物對42個煙草品系進行遺傳多態性研究，結果顯示其遺傳距離為0.21到0.92。Ren等［16］用AFLP分子標記分析了41個煙草栽培種和7個野生煙草種的遺傳多態性，結果表明，煙草種間遺傳距離在 0.28～0.58，種間遺傳多樣性豐富。本研究所用引物平均PIC值達到0.63，這些引物能在某些煙草種質中擴增出特異帶型，由此說明這些引物可用于煙草種質遺傳多樣性。本試驗41對SSR引物對87份煙草種質的分析結果表明烤煙內的遺傳相似性較高，種間的遺傳差異較大，87份煙草品種包含了烤煙、晾曬煙、白肋煙、雪茄煙和香料煙5個栽培類型，較好地表現出了遺傳多樣性特征，這與以往的研究［17-21］結果相一致。聚類分析圖顯示，個別品種會偏離原有類型，說明在不同生態條件下，人為目的的長期選擇逐漸形成了不同栽培類型；個別品種偏離原有類型，和其他類型聚在一起，主要與親源關系有關；煙草種質間的遺傳差異與品種調制類型、地理來源的差異沒有較大的聯系。

圖1　煙草總群體和不同類群中的后驗概率和△K值Fig. 1 Posterior probability and delta k values of tobacco groups and different groups

圖2　87個煙草品種的群體結構示意圖Fig. 2 Group structure diagram of 87 tobacco varieties

就中美主要煙草品種親源關系進行研究，發現世界主產煙國家的煙草育種也基本在美國育成品種的基礎上發展起來的，各國的主栽品種都有美國品種的親源成分，我國的煙草育種更不例外［1］；而本研究聚類分析和群體結構分析結果顯示美國品種資源在不同亞群間出現一定程度的交叉現象。較高的遺傳多樣性是維持物種長期生存的基礎，為提高煙草品種的產量、品質及抗性，可以利用生物工程的方法實現野生種優良基因向栽培品種轉移的目的，從而創造更有利用價值或特殊作用的煙草新品種。

4　結　論

供試煙草種質材料 SSR分子標記揭示了煙草種間存在較豐富的遺傳多樣性，烤煙品種內遺傳基礎相對狹窄。少數品種或類型聚類時出現交叉現象，與其親源關系有關，與地理來源及調制類型關系不大。本研究可為進一步開展煙草種質資源指紋圖譜研究及利用種內種間遺傳差異較大的材料拓寬煙草遺傳基礎、發掘有利基因和改良煙草品種提供理論依據。

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Analysis of Genetic Diversity and Population Structure of Germplasm Resources in Nicotiana tabacum

ZHANG Mingzhen， XING Xuexia， LI Xiaohui， YANG Tiezhao， XU Shixiao*
（College of Tobacco Science， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

The population structure and genetic diversity of tobacco provide a theoretical basis for identifying elite genes and improving varieties by breeders. Genetic diversity and population structure of 87 tobacco materials were evaluated using 41 polymorphic SSR markers screened from a total of 80 SSR primer pairs. The amplified fragment length polymorphism was detected by The Applied Biosystems 3500 xl Genetic Analyzer. The results revealed that a sum of 241 polymorphism sites were found using the 41 SSR primer pairs， with an average of 5.88 sites per primer pair. The genetic similarity coefficient ranged from 0.47-0.91， and the PIC averaged 0.63， ranging from 0.23-0.91. Results from the clustering analysis based on a model-based method indicated that when K=2， the largest delta K value， namely 87 tobacco materials can be divided into two groups （P1 and P2， with the P1 group further divided into five classes and the P2 group further divided into two classes. The genetic diversity of tobacco germplasm was abundant and the division of population structure was not completely related to germplasm type.

tobacco； SSR fluorescent markers； genetic diversity； population structure

S572.03

1007-5119（2016）04-0042-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.04.008

中國煙草總公司重大項目“高抗根結線蟲病優質烤煙新品種選育”（110201402004）

張銘真（1992-），女，碩士研究生，研究方向為煙草遺傳育種與生理。E-mail：yczhangmingzhen@163.com*通信作者，E-mail：xushixiao@126.com

2016-01-25

2016-03-05