微生物強化對椒坯發酵群落多樣性及性質的影響

梁如，黃鈞，張立強，崔瑞迎，吳重德，廖昌明，李紅，周榮清,2,3*

1(四川大學 輕紡與食品學院，四川 成都，610065)　2(國家固態釀造工程技術研究中心，四川 瀘州，645000) 3(四川大學 制革清潔技術國家工程實驗室，四川 成都，610065)　4(成都鑫鴻望食品有限公司，四川 成都，611741)

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微生物強化對椒坯發酵群落多樣性及性質的影響

梁如1，黃鈞1，張立強1，崔瑞迎1，吳重德1，廖昌明4，李紅4，周榮清1,2,3*

1(四川大學 輕紡與食品學院，四川 成都，610065)2(國家固態釀造工程技術研究中心，四川 瀘州，645000) 3(四川大學 制革清潔技術國家工程實驗室，四川 成都，610065)4(成都鑫鴻望食品有限公司，四川 成都，611741)

描述了應用磷脂脂肪酸(phosphoric acid fatty acids,PLFAs)及聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技術研究微生物強化發酵椒坯群落多樣性變化的規律。研究表明，高鹽發酵使椒坯的細菌生物量顯著降低；對于強化的樣品，因所使用的菌株及強化方式不同，其群落多樣性及優勢菌差異顯著，假絲酵母菌Candidaversatilis強化提高了椒坯總生物量，魯氏酵母Zygosaacharomycerouxii則相反；共培養強化提高了椒坯以Tetragenoccus和Zygosaacharomyces為主的優勢菌的生物量，同時發現嗜鹽四鏈球菌Tetragenoccushalophilus對Vagococcus具有明顯的抑制作用。理化研究表明，不同強化方式使樣品的總酸(TA)、還原糖(RS)和氨基態氮(FN)等參數略有差異。不同強化方式對揮發性組分貢獻不同，其中，共培養強化使椒坯揮發性組分總含量提高了28.46%。該研究揭示了強化發酵對椒坯微生物群落和品質的影響規律，對微生物強化技術在傳統發酵的應用有一定的指導作用。

微生物群落；共培強化；揮發性組分；磷脂肪酸(phosphoric acid fatty acids,PLFAs)；聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)

辣椒(CapsicumannumL.)是在墨西哥、印度和中國等多個國家普遍種植的一年生或多年生的草本植物，常被作為香辣型蔬菜直接食用或是許多發酵調味品的原料。其中，辣椒醬就以辣椒為原料發酵而成的具有獨特的辛辣味、鮮艷色澤和質地的佐餐調味品[1-2]，同時也是郫縣豆瓣等調味品的中間制品。高鹽發酵是我國辣椒醬生產的主要工藝，辣椒本身產生的內源酶及發酵過程中自然混入的多種微生物對辣椒醬獨特的品質形成有重要貢獻。因此，高鹽環境、季節影響和亞硝酸鹽易積累等因素是妨礙產業集約化生產的技術難題。微生物強化發酵技術是解決這一難題的有效嘗試，最近發表的有關純種強化發酵報道[3-7]，證實了純種強化有益于產品品質的改善。然而，因辣椒的品種、產地和栽培技術的差異會影響辣椒堿和辣椒素的含量，從而對微生物的生長繁殖作用各異[8-9]，所以難以應用可培養技術了解強化菌株的作用規律及優化強化工藝。本文報道了基于磷脂脂肪酸(phosphoric acid fatty acids,PLFAs)及變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)免培養技術研究了假絲酵母Candidaversatilis、魯氏酵母Zygosaacharomycerouxii和嗜鹽四鏈球菌Tetragenoccushalophilus及3株微生物共培對椒坯微生物群落結構的影響規律，同時研究了椒坯總酸、氨態氮和游離氨基酸等理化指標及揮發組分的變化，揭示了菌株間的作用特點，對科學認識強化椒坯發酵和強化工藝的優化具有指導和借鑒作用。

1　材料與方法

1.1微生物、培養基及培養條件

微生物：耐鹽酵母菌C.versatilisCGMCC 3790和Z.rouxiiCGMCC 3791；耐鹽乳酸菌T.halophilusCGMCC 3792。本實驗室分離并保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiologiocal Culture Collection Center,CGMCC)。

種子培養基：(1)酵母菌：含120 g/L NaCl的YM培養基[9]；(2)乳酸菌：含90 g/L NaCl的MRS培養基[10]。YM和MRS培養基的pH分別調為5.0、7.0于115 ℃滅菌15 min后，分別從活化的菌株斜面試管中挑2～3環，分別置于30±1 ℃和37±1 ℃的培養箱中靜置培養至對數期。

1.2實驗方法

1.2.1原料與樣品制備

干辣椒 (美國紅，甘肅，2013年)經挑選、清洗、浸泡和粉碎后，分別將鹽分和水分調至約15%和63%。分別將T.halophilus、C.versatilis和Z.rouxii的純培養物接種到椒坯中，初始菌濃分別為5.2×107CFU/g (CS4)、4.1×106CFU/g (CS5)和5.3×106CFU/g (CS6)。將另一部分接種T.halophilus純培養物(初始菌濃為5.2×107CFU/g)椒坯發酵至pH5.8以下時，再接入Z.rouxii和C.versatilis純培養物，使其濃度分別為4.8×106CFU/g和5.8×106CFU/g (CS3)。未做任何處理椒坯為自然發酵組 (CS2)。將制備好的椒坯置于常溫環境中發酵30 d，每隔6 d攪拌1次，CS1為未發酵椒坯樣品。

1.2.2理化指標的檢測

水分測定：GB/5009.3—2010的第一法 (直接干燥法)；NaCl含量的測定:GB/T 12457—2008；FN的測定：GB/T 5009,39；TA的測定：GB/T 12456—2008 (以乳酸計)；RS的測定：GB/T5009.7—2008 (直接滴定法)。游離氨基酸(FAA)的檢測：精確稱取樣品5.00 g，研磨后，蒸餾水定容至50 mL，取10 mL濾液，加5 mL 10%三氯乙酸溶液，室溫靜置2 h后，離心 (10 000×g，4 ℃) 10 min，上清液經0.45 mm濾膜過濾并適當稀釋后，用自動氨基酸檢測儀(A300, membrace Pure GmbH，德國)檢測FAA的含量。

1.2.3揮發性組分檢測

采用頂空-固相微萃取氣相色譜-質譜法(HS-SPME-GC-MS)測定樣品的揮發性組分[11]。稱取研磨至膏狀的樣品0.50 g于頂空瓶中，加入內標辛酸和辛酸甲酯各10 μL，60 ℃平衡15 min，插入固相微萃取頭 (CAR/PDMS，85 μm，supelco，USA)，萃取45 min。然后在進樣口中解吸3 min，檢測揮發性組分。色譜條件：色譜柱為HP-INNOWAX毛細管色譜柱 (30.0 m×0.32 mm×0.25 μm，J&W，USA)；升溫程序：40 ℃保持5 min，以4 ℃/min升至100 ℃，再以6 ℃/min升至230 ℃，保持10 min，進樣口溫度250 ℃；載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min；離子源溫度和連接線溫度分別為230和250 ℃；EI電子能量為70 eV；質量掃描范圍35～400 amu。

1.2.4PLFAs

樣品中PLFAs提取和分析，參考文獻[12-13]所述的方法提取樣品中PLFAs，檢測條件：色譜柱為HP-INNOWAX毛細管色譜柱(30.0 m×0.32 mm×0.25 μm，J&W，USA)進樣口為高純氮氣溫度250 ℃，進樣量0.5 μL，分流比10∶1；載氣和連接線流速1.0 mL/min；起始柱溫40 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min升至220 ℃，保持10 min；質譜 (EI)的電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；掃描范圍35～400 amu。

1.2.5PCR-DGGE

稱取5.00 g樣品，轉移至裝有無菌玻珠的離心管中，加入20 mL PBS (0.1mol/L，pH8.0)，渦旋振蕩分散后，離心10 min (800×g，4 ℃)，相同PBS洗滌沉淀物2次，匯集的上清液離心 (10 000 ×g，4 ℃)10 min，棄上清液，洗滌菌團3次，轉移到1.5 mL的EP管中，-20 ℃保存待用。參考文獻[14]所述方法提取總DNA，經試劑盒 (Universal DNA Purification Kit，Tiangen Biotech (Beijing)Co., Ltd.)純化后，用表1中所示的引物，按參考文獻[15-18]所述方法完成巢氏PCR。按參考文獻[19-20]進行DGGE分析。切割具有代表性條帶，加入適量ddH2O后置于4 ℃冰箱中過夜，收集DNA溶出片段，經1%瓊脂糖電泳檢測純度后，送樣至上海生工進行測序分析。將有效的DNA序列與NCBI的BLAST(www.ncbi.nlm nih.gov/BLAST)以及RDP CLASSIFIER (http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp) 數據庫的序列比對獲得最近親緣關系相關菌株信息。

表1　所用引物對及其序列

注：1)下劃線堿基為GC夾。

2.2.5數據處理

揮發性組分的鑒定及數據處理：通過待測樣品組分質譜數據與標準譜庫(NIST05)比對，匹配度大于800 (最大為1 000)的物質予以報道，采用峰面積歸一化法(內標法)確定樣品中各檢出物質的含量，揮發性組分含量以平均值±標準偏差 (n=3)。

PLFAs鑒定及數據處理：通過待測樣品各組分質譜圖與NIST05標準譜庫比對，以及保留時間與37種FAME標準品 (Accustandard，USA)保留時間的比較，確定PLFAs組成；采用內標(19∶0)歸一化法計算各組分的含量，樣品中PLFAs含量用nmol/g dw表示。參考文獻[21]所述的方法命名PLFAs，參考文獻[22-24]所述方法估算其菌群的構成及相對含量，含量以平均值±標準偏差 (n=3)。

DGGE多樣性指數：將 DGGE光密度數據導入ZZSTAT軟件 (v2010)，計算細菌和真菌的多樣性指數。

采用SPSS 16.0軟件 (SPSS，USA)進行不同樣品間的聚類分析，距離計算方法為歐氏距離和樣品間的差異性分析(兩因素方差分析 Two-way ANOVA，Duncan's test，P<0.05)。

2　結果與討論

2.1對細菌群落多樣性的影響

2.1.1基于PLFAs的椒坯細菌群落多樣性的變化

樣品中共檢出了8種PLFAs，碳鏈長度在14～18之間，總PLFAs含量依次是CS1 (4.78 nmol/g)>CS5 (1.15 nmol/g)>CS3 (1.06 nmol/g)>CS2 (0.79 nmol/g)>CS4 (0.78 nmol/g)>CS6 (0.59 nmol/g)。包括直鏈和支鏈飽和、單不飽和及多不飽和4類PLFAs，其中直鏈飽和及多不飽PLFA比例較高，所占比例分別在40.33%～46.09%和27.32%～44.09%。其中，i14∶0,16∶0和18∶2ω9,11為優勢PLFAs。

椒坯菌群及生物量估算結果表明，與初始樣品比較，發酵椒坯的G+、G-菌和真菌含量及其比例變化顯著(P<0.05)，強化致使G+菌和真菌為優勢菌，除CS6外，各樣品間的生物量無顯著差異 (P<0.05)(表2)。自然發酵使細菌生物量減少，G+菌為絕對優勢菌群。與自然發酵相比C.versatilis和Z.rouxi單獨強化使椒坯中G+和G-菌生物量降低，且C.versatilis使真菌的生物量增加，Z.rouxii則相反，這可能是代謝產物乙醇、有機酸等的抑制及底物競爭性消耗等所致，但二者的菌群差異的原因有待深入探討。由于T.halophilu產生有機酸的抑菌作用，使真菌的生物量降低。共培養則使總生物量和真菌量略有提高。

表2　樣品間微生物群落的區別

注：1)含量表示為平均值±標準差nmol/g dw；2)同一行中不相同字母表示差異顯著(Duncan’s test，P<0.05)；3)ND 表示未檢出；4)表示未計算。

2.1.2基于PCR-DGGE的微生物群落結構的研究

細菌DGGE圖譜(圖1a)的多樣性指數分析結果表明，自然發酵使S和H指數減少，D指數增加，強化發酵則使D指數減小，S和H指數增大。因菌株性質和不同強化方式不同，致使樣品的微生物群落多樣性亦有差異，C.versatili和共培使S和H的增幅高于T.halophilus和Z.rouxii，D指數則降幅較大(表3)。據DGGE圖譜的強度特征聚為兩簇，CS5 (C.versatili)是一簇，其余樣品的聚為另一簇，相似度大于59.60%，CS2和CS6相似性接近而聚相同亞簇，CS3和CS4因T.halophilus參與強化，其代謝物有效抑制了雜菌，結構類似聚為相同亞簇(圖1b)。

測序結果在NCBI和RDP CLASSIFIER中檢索比親緣性的結果表明(表4)，細菌涉及3個不同科(Enterobacteriaceae、Enterococcaceae和Bacillaceae)，由Pantoea、Tetragenococcus、Vagococcus、Bacillus和Enterobacter等5個屬構成。CS1所含的4個屬的細菌(Pantoea/條帶1、Vagococcus/條帶4和條帶12、Enterobacter/條帶10和條帶11)，Vagococcus屬菌為CS2的優勢菌。Tetragenococcus屬菌是CS3和CS4的優勢菌(條帶3和條帶5-8)，這與接入的T.halophilus的強耐鹽性、高的繁殖率和具有競爭性抑制自然混入細菌等特性有關。Vagococcus(條帶4和條帶12)和Bacillus(條帶9)為CS5和CS6的優勢菌，這可能是Z.rouxii和C.versatilis的代謝產物如乙醇和有機酸等對細菌抑制作用所致。Bacillus是兼性厭氧菌，起始時耗氧迅速，致使溶氧降低，有益于厭氧菌繁殖，產生的有機酸，降低了椒坯的pH值，致使E.asburiae和E.cloacae等致病菌[25]消失，產生的水解酶促進了蛋白質、多種糖類等的降解[26]。由此可見椒坯的高鹽微生物強化發酵不僅能改善風味，也能抑制或消除雜菌。可能因T.halophilus對Vagococcus有較強的抑制作用，在CS3和CS4均未檢出Vagococcus。

表3　不同樣品細菌和真菌多樣性指數

1-6泳道分別表示CS1-CS6號樣品; R1-6分別對應CS1-CS6號樣品圖1　樣品間細菌DGGE圖譜(a)和聚類分析(b)Fig.1　DGGE profile of bacteria(a) and Hierarchal cluster analyses(b) in sample

真菌DGGE圖譜 (圖2a)多樣性指數分析結果表明，自然發酵、T.halophilu和C.versatilis強化使S和H指數略增，而D指數略減，Z.rouxii與共培強化則使S和D指數減小，H指數增加 (表3)。聚類分析的結果表明，樣品間的群落結構相似度較高，原料和自然發酵的樣品聚為一簇 (相似度>84.69%)，純種強化聚為另一簇 (相似度>84.88%)。酵母菌強化 (CS3、CS5和CS6)聚為亞簇(相似度>90.92%)，C.versatilis因其功能是發酵后期產酯，所以另聚為一小簇(圖3b)。測序結果結果表明 (表4)，所有樣品中只檢出Z.rouxii和Z.pseudorouxii兩種酵母菌。在CS3和CS5號中雖然采用了C.versatilis強化，測序的結果未檢出。可能是椒坯的環境不適合其大量繁殖或DNA提取方法等限制[16]，詳細原因待進一步探討。

表4　細菌和真菌DNA測序及與BLAST和RDP數據庫比對結果

1-6泳道分別表示CS1-CS6號樣品；R1-6分別對應CS1-CS6號樣品圖2　真菌DGGE圖譜(a)和聚類分析(b)Fig.2　DGGE profile of fungal(a) and Hierarchal cluster analyses(b) in samples

2.2對理化性質的影響

表5為不同強化方式樣品發酵結束時理化指標，發酵過程中因水分蒸發，需間歇補水，導致水分和鹽分含量略有波動。T.halophilus和C.versatilis強化，使椒坯的TA、FN和RS含量略有增高 (P<0.05)，Z.rouxii強化使TA的含量略有減少 (P<0.05)，可能與Z.rouxii在椒坯中快速生長繁殖有關。共培養強化對TA、FN和RS含量無明顯影響 (P<0.05)。

2.2.1對游離氨基酸含量的影響

檢測各樣品中的FAA的結果表明 (表6)，自然發酵使檢出的17種FAA中15種FAA增加，其中，Thr、Ser、Ala 、Met、Ile和Arg的增幅超過20%；相對自然發酵，T.halophilus強化使16種FAA的含量增加，與樣品中FN含量變化一致，其中His增加了4倍，Arg的含量減少了15.13%，增幅超過20%以上的包括Asp (29.56%)、Thr (49.65%)、Glu (57.85%)、Gly (45.95%)等11種FAAs；Z.rouxii和C.versatilis的強化使Thr、Ser、Asn、Gly、Ala、Met、Ile、Phe、Trp和Arg等11種FAA含量降低，但使Glu的含量分別提高了27.53%和34.78%，Lys的含量分別提高了13.68%和21.05%；共培強化則使Glu提高了20.17%，Cys 和lys 分別提高了16.41%和13.68%。

表5　不同樣品理化性質的區別

注：1)同一行中不同字母表示有顯著的差別(Duncan’s test,P<0.05)。

2.3對揮發性組分的影響

各種樣品共檢出了50種不同揮發性組分，包含1種酸、9種醇、17種酯、4種醛、8種酮、5種酚、1種吡嗪及5種其他組分。自然發酵分別使醇和醛類組分分別從266.24 mg/kg，19.44 mg/kg增加到464.82 mg/kg和129.62 mg/kg。相對自然發酵，T.halophilius的強化，醇、酯組分略減，酚類組成稍增(圖3)，致使總揮發組分含量略減。Z.rouxii和C.versatilis的強化，使椒坯中的醇組分含量增加、酯類和其它類組分略增，酚類減少，醛類略減，前者使酮類和烷烴類組分略減少，而后者則是使之稍增(圖4)。Z.rouxii、C.versatilis和T.halophilius的共培養強化則使揮發組分總的含量提高了28.46%，達到1764.93 mg/kg。醇類和酯類組分別增加了38.09%和40.92%，酚類組分降低了31.92%。苯乙醇，從330.66 mg/kg增加到447.05 mg/kg，但其比例略有減少，相對比例增幅較大是異丁醇，提高了5.2倍，其次是4-甲基-戊醇和3-甲基-丁醇。酯類組分中含量較高的4種組分，依次為辛酸乙酯(24.10%)>月桂酸乙酯(20.87%)>棕櫚酸乙酯(13.69%)>肉桂酸乙酯(13.54%)。強化作用使其乙酸異戊酯和辛酸-3-甲基丁酯增幅最高，分別是7.78倍和1.88倍，葵酸、辛酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、順-9-十六烯酸、月桂酸、十五碳酸、苯乙酸乙酯、壬酸和己酸等9種酸的乙酯組分的增幅超過了30%。在檢出的酚類組分中，苯酚的含量從87.85 mg/kg降至34.88 mg/kg，降幅為60.30%，而4-乙基愈創木酚，4-乙烯基愈創木酚和4-乙基苯酚則有較大的增幅。

表6　不同樣品中游離氨基酸含量

注：1)同一行中不同字母表示存在顯著的差別 (兩因素方差分析，Duncan’s test,P<0.05)。

編號1-6分別代表CS1-CS6圖3　樣品間各類揮發性組分的比例Fig.3　Different ratio of volatile components in samples

3　結論

基于PLFAs和DGGE所獲得互補的強化的信息，定量表征了不同菌株強化的特點及對微生物群落多樣性的影響規律。Z.rouxiiCGMCC 3791在椒坯中具有較強的繁殖能力，而C.versatilisCGMCC 3790則較弱。T.halophilusCGMCC 3792強化能有效地抑制其它細菌，尤其是對Vagococcus的抑制。椒坯的發酵具有“自凈化” (滅雜菌)和改善了品質的作用，不同強化對方式TA、FN、 RS和FAA及各種揮發組分含量的影響，因所用菌株的生理特性的不同而異。3種微生物共培強化對TA、FN和RS的含量無明顯影響，醇類和酯類組分為主的揮發組分的含量顯著提高，而酚類組分則有所減少。

[1]AHMED J,SHIVHARE U S,RAGHAVAN G S V.Rheological characteristics and kinetics of colour degradation of green chilli puree [J].Journal of Food Engineering,2000,44(4):239-244.

[2]GOVINDARAJAN V S,RAJALAKSHMI D, CHAND N,et al.Capsicum-production,technology, chemistry, and quality. Part IV.Evaluation of quality [J].Critical Reviews in Food Science & Nutrition,1987,25(3):185-282.

[3]萬春秋,劉德忠.乳酸菌在干辣椒發酵中的應用[J].中國調味品,2015,40(1):52-56.

[4]楊玉新,任花,李丹.辣椒醬復合菌種發酵工藝的研究[J].中國釀造,2011,30(8):162-164.

[5]余有貴,曹智華,曾傳廣,等.乳酸菌強化發酵生產辣椒醬的工藝研究[J].中國釀造, 2009,28(12): 94-97.

[7]胡小華,孫琳杰,王宇平,等.干紅辣椒制作發酵型辣椒醬的工藝研究[J].食品科技,2008, 33(6):129-130.

[8]OMOLO M A,WONG Z,MERGEN A K,et al.Antimicrobial properties of Chili peppers[J].Journal of Infectious Diseases and Therapy,2014,2(4).doi:10.4172/2332-0877.1000145.

[10]沈萍,陳向東.微生物學試驗(第4版)[M].北京:高等教育出版社,2007:245.

[11]凌代文,東秀珠.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法 [M].北京:中國輕工業出版社,1999: 51-128.

[12]GAO Xian-li,CUI Chun,ZHAO Hai-feng,et al.Changes in volatile aroma compounds of traditional Chinese-type soy sauce during moromi fermentation and heat treatment[J]. Food Science and Biotechnology,2010,19(4):889-898.

[13]ZELLES L,BAI Q Y.Fractionation of fatty acids derived from soil lipids by solid phase extraction and their quantitative analysis by GC-MS [J].Soil Biology and Biochemistry, 1993,25(4):495-507.

[14]WHITE D C,STAIR J O,RINGELBERG D B.Quantitative comparisons ofin situ microbial biodiversity by signature biomarker analysis[J].Journal of Industrial Microbiology,1996, 17(3):185-196.

[15]ZHOU J,BRUNS M A,TIEDJE J M.DNA recovery from soils of diverse composition[J].Applied and Environmental Microbiology,1996,62(2): 316-322.

[16]KIM T W,LEE J H,KIM S E,et al.Analysis of microbial communities in doenjang, a Korean fermented soybean paste, using nested PCR-denaturing gradient gel electrophoresis[J]. International Journal of Food Microbiology,2009,131(2):265-271.

[17]MATSUYAMA T,Y NAKAJIMA,K MATSUYA,et al.Bacterial community in plant residues in a Japanese paddy field estimated by RFLP and DGGE analyses[J].Soil Biology and Biochemistry,2007,39(2):463-472.

[18]THANH V N,TUAN D A.Microbial diversity of traditional Vietnamese alcohol fermentation starters(banh men) as determined by PCR-mediated DGGE[J].International Journal of Food Microbiology,2008,128(2):268-273.

[19]ABE M,TAKAOKA N,IDEMOTO Y,et al.Characteristic fungi observed in the fermentation process for Puer tea[J].International Journal of Food Microbiology,2008,124(2):199-203.

[20]MUYZER G,DE Waal E C,UITTERLINDEN A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA[J].Applied and Environmental Microbiology,1993,59(3): 695-700.

[21]HARUTA S, KONDO M, NAKAMURA K, et al.Microbial community changes during organic solid waste treatment analyzed by double gradient-denaturing gradient gel electrophoresis and fluorescence in situ hybridization [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2002, 60: 224-231.

[22]FROSTAGARD ?,TUNLID A,B??TH E.Phospholipid fatty acid composition, biomass, and activity of microbial communities from two soil types experimentally to different metals exposed heavy [J]. Applied and Environmental Microbiology,1993,59(11):3 605-3 617.

[23]ZELLES L.Identification of single cultured micro-organisms based on their whole-community fatty acid profiles, using an extended extraction procedure[J].Chemosphere,1999,39(4): 665-682.

[24]BARDGETT R D,HOBBS P J,FROSTEG?RD ?.Changes in soil fungal: bacterial ratios following reductions in the intensity of management of upland grassland[J].Biology and Fertility of Soils,1996,22:261-264.

[25]WHITE D C,DAVIS W M,NICKELS J S,et al.Determination of the sedimentary nicrobial biomass by extractible lipid phosphate [J].Oecologia,1979,40: 51-62.

[26]張海.大豆醬發酵過程中乳酸菌和酵母菌的作用[J].中國調味品,1993(6):14-20.

[27]黃備,金衛紅,徐海剛,等.不同環境溫度下的大腸桿菌數量監測及生存機制研究[J].浙江海洋學院學報(自然科學版),2002(2):22-24.

Effect of strengthen fermentation on the microbial diversity and the physicochemical properties of minced chilli (Capsicumannum)

LIANG Ru1, HUANG Jun1, ZHANG Li-qiang1, CUI Rui-ying1,WU chong-de1, LIAO Chang-ming4, LI Hong1, ZHOU Rong-qing1,2,3*

1(College of light industry, Textile &Food Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, China) 2(National Research Center of solid-state Brewing, Luzhou 646000，China) 3(National Engineering Laboratory for Clean Technology of Leather Production, Chengdu 610065, China) 4(Chengdu Xin-Hong Wang Food Co.Ltd.,Chengdu 611741, China)

In the present research，the changes of the microbial community diversity in the strengthening fermented minced chilli (CapsicumannumL.) were investigated by phospholipid fatty acids (PLFAs) combined with polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE). The result showed that total biomass of bacteria was decreased significantly through high-salt fermentation. The difference of microbial community diversity and dominant strains was also observed due to the difference of strains inoculated and the strengthening patterns. Total biomass was increased byCandidaversatilis, while that was decreased byZygosaacharomycesrouxii, and that of the co-culturing sample, which were mainly composed ofTetragenoccusandZygosaacharomyces, was increased compared with natural fermentation. It was worthy to note thatTetragenoccushalophilusshowed significant inhibition effect onVagococcus. The physiochemical properties of various samples, which were major titratable acidity (TA), reduce sugar (RS) and free amino nitrogen (FN), were slightly different due to the divergence of microorganisms inoculated. The influences of strengthening patterns on total content of volatile components were different, especially co-culturing sample showed the highest augmenter about 28.46% compared with natural fermentation. The results of this study suggested that not only the microorganisms but also the strengthen patterns had significant effect on the microbial community and the quality of minced chilli.

microbial community; co-culturing; volatile compounds; PLFAs; PCR-DGGE

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601003

在讀博士研究生(周榮清教授為通訊作者，E-mail：zhourqing@scu.edu.cn)。

國家自然基金項目資助(31171742)；四川省科技支撐計劃(2014SZ0129)

2015-08-15，改回日期：2015-09-11