利用冷凍保藏菌種測定食品中的水溶性維生素

李全霞，崔亞娟,2*，陳兆天，張績覓，徐佳佳，劉玉峰

1(北京市營養源研究所 分析檢測中心，北京，100069)　2(中國農業大學農學與生物技術學院，北京，100193)

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利用冷凍保藏菌種測定食品中的水溶性維生素

李全霞1，崔亞娟1,2*，陳兆天1，張績覓1，徐佳佳1，劉玉峰1

1(北京市營養源研究所 分析檢測中心，北京，100069)2(中國農業大學農學與生物技術學院，北京，100193)

建立了一種簡單的甘油保護的冷凍保藏菌種的制備方法，通過測定冷凍菌種的活菌數和標準曲線，研究冷凍菌種的穩定性和重復性。結果顯示，-20 ℃下保藏8個月時，冷凍菌種保藏液中的活菌數仍達到107CFU/mL以上，利用冷凍菌種測定煙酸、泛酸、葉酸和生物素的標準曲線與傳統方法的標準曲線高度一致，利用冷凍保藏的菌種和新鮮菌種同時進行6種樣品的分析，結果沒有顯著差異。冷凍菌種表現穩定，使用方便，快捷，適合作為菌種來源。

微生物法；煙酸；泛酸；葉酸；生物素

維生素是生物體內具有生理活性的物質，是一種食物或者膳食營養價值的真實反映。食物中某些維生素的生物活性可以作為食物營養價值評價標準的一部分。測定生物活性的最直接手段就是利用基于生理功能的生物分析方法。這也是維生素被發現的原因，至今我們也還在利用此方法去估量其他具有潛在治療益處的維生素類似物[1]。隨著儀器分析方法的迅猛發展，一些新的測定維生素的方法不斷涌現，如高效液相-柱后衍生熒光法、液相色譜-質譜聯用、超高效液相色譜-串聯質譜法等[2-5]。微生物分析維生素方法因為其高的靈敏度和可靠性，測定結果可涵蓋食物中添加和天然兩種類型，從1940年代一直沿用至今。

由于微生物對維生素的特異活性，微生物法很長時間被喻為“黃金標準”方法，所有的B族維生素都能夠利用微生物法進行測定[6]。所使用的分析菌種都來自于美國典型培養物培養中心(American Type Culture Collection,ATCC)。目前，國標方法中除了維生素B6使用酵母菌檢測外，其他測定方法所使用的菌種都屬于乳酸桿菌。

水溶性維生素一般是作為輔酶或輔基參與到機體的基礎代謝反應中，是生物體生長必需的營養素。自然界中某些細菌或真菌也需要維生素維持生長，但本身并不能合成維生素，屬于營養缺陷型的菌株，采用微生物分析維生素的原理就來源于此。在使用微生物進行測定過程中，保持營養缺陷型菌株的代謝活性對維生素的定量至關重要。傳統的連續傳代保存方法容易引入基因突變或者雜菌，培養基的理化性質及微生物代謝產物等原因還會導致微生物性狀發生改變[7]。因此應該與其他能夠長期保存菌株的方法相結合防止菌種衰退。1980年，GROSSOWLCZ等首先利用甘油保護的菌種進行血液中葉酸分析[8]。1982年，Willon和Horne對冷凍菌種的制備方法進行了改良，將其用于大鼠組織部分中葉酸的測定分析[9]。2005年，美國分析化學家協會(Association of Official Analytical Chemists,AOAC)將冷凍菌種寫入官方分析方法2004.05中，用于谷物中葉酸的測定[10]。2007年，BUI和SMALL利用冷凍菌種測定面條中的葉酸[11]。2010年，Ortiz-Escobar等參照Grossowlcz的制備方法重新改良用來測定墨西哥仙人掌頸中的葉酸[12]。2011年，徐文婕等將甘油冷凍保存乳酸桿菌與96孔酶標相結合檢測血漿葉酸[13]。筆者參照WILLON和HORNE的菌種制備方法，結合實驗室現有的條件，建立了制備測定煙酸、泛酸、葉酸和生物素的冷凍保藏菌種方法，并應用于日常的檢測分析中。經過8個多月的對比分析，該冷凍菌種表現穩定，使用方便，快捷。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

菌種：植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)ATCC 8014，鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)ATCC 7469。

乳酸桿菌肉湯培養基，北京陸橋技術有限責任公司；煙酸測定培養基、泛酸測定培養基、生物素測定培養基、葉酸測定培養基，美國Difco公司。雞胰酶，上海物競化工公司；淀粉酶，美國Sigma公司；蛋白酶，國藥集團化學試劑有限公司；煙酸(≥99.9%)、泛酸鈣(≥99.9%)、生物素(≥98.0%)、葉酸(≥98.0%)，美國Sigma公司；抗壞血酸、甘油、氫氧化鈉、硫酸、乙醇，分析純。

1.2儀器與設備

BPMJ-250F恒溫培養箱；日立U-3900H紫外分光光度計；TOMY SX-700高壓蒸汽滅菌鍋；NU-425-400E生物安全柜；Sartorius千分之一和萬分之一電子天平；BCD-235新飛冰箱；BCD-130HTB海爾超低溫保存箱。

1.3方法

1.3.1標準溶液的配制

1)煙酸標準儲備溶液的配制：準確稱取20.0 mg煙酸，用25%乙醇溶液溶解并定容至100 mL[14]。

2)泛酸標準儲備溶液的配制：準確稱取21.25 mg泛酸鈣標準品，溶于50 mL蒸餾水中，加入1 mL 0.2 mol/L乙酸，10 mL 0.2 mol/L醋酸鈉，然后用蒸餾水定容至100 mL加3滴甲苯，于4 ℃冰箱保存[15]。

3)生物素標準儲備溶液的配制：準確稱取20.0 mg生物素50%乙醇溶液溶解并定容至100 mL[16]。

4)葉酸標準儲備溶液的配制：準確稱取20.0 mg葉酸，用0.01 mol/L氫氧化鈉乙醇(1∶4)溶液溶解并定容至100 mL[17]。

1.3.2培養基的配制

1)乳酸桿菌肉湯培養基：按照培養基說明進行配制。

2)乳酸桿菌瓊脂培養基：按照乳酸桿菌肉湯培養基說明進行配制，加入1%瓊脂。

3)測定用培養基：按照培養基說明配制。

4)冷凍保藏菌種培養液：測定培養基中加入相應含量的維生素工作溶液，使得相應的培養液中維生素濃度分別為煙酸、泛酸20 ng/mL葉酸、生物素0.2 ng/mL。

1.3.3甘油溶液的配制

取甘油80 mL加入20 mL蒸餾水，混勻，121℃滅菌30 min。

1.3.4菌種的活化

將純菌種植物乳桿菌和干酪乳桿菌穿刺接種于柱狀乳酸桿菌瓊脂培養基中，在36℃±1℃培養19～22 h。培養好的乳酸桿菌瓊脂培養基試管的培養物作為儲備菌種。

1.3.5冷凍保藏菌種的制備

接種1環儲備菌種瓊脂培養物于5 mL乳酸桿菌肉湯培養基中，在36℃±1℃培養19～22 h；取0.5 mL種子培養液接入50 mL冷凍保藏菌種培養液中，36 ℃±1 ℃培養19～22 h。立即取出放入冰浴中。在無菌環境中取1 mL培養液于滅菌的2 mL離心管中，加入1 mL 甘油，混勻，放入-20 ℃和-70 ℃冰箱保存。

1.3.6接種量試驗

冷凍菌種保藏1個月內進行接種量的試驗，分別按照0.25%，0.5%，1%，2%，4%，8%體積分數的接種量接種于空白試管和煙酸、泛酸20 ng/mL，葉酸、生物素0.2 ng/mL的試管中，在36℃±1℃培養19～24 h，測定吸光值，比較空白管和標準管的差異，判斷最佳接種量。

1.3.7冷凍菌種中活菌的計數

每月取冷凍菌種溶液，稀釋到合適梯度后利用乳酸桿菌瓊脂培養基平板培養36 h，計數，計算每毫升菌液中的活菌落數。

1.3.8標準曲線的制備

取煙酸、泛酸標準儲備液1.00 mL稀釋至質量濃度為20 ng/mL，6支試管加2.50 mL測定用培養基，再加0～50 ng標準工作溶液，一式3份；取葉酸、生物素標準儲備液1.00 mL稀釋至質量濃度為0.2 ng/mL，6支試管加2.50 mL測定用培養基，再加0～0.5 ng標準工作溶液，一式3份。

以最佳接種量進行接種，在36℃±1℃培養19～24 h。培養后的標準管從恒溫箱中取出后，用分光光度計于550 nm波長下，以標準管的零管調零，測定各管的吸光度值。以標準所含的維生素質量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準工作曲線。

1.3.9樣品測定及分析

樣品處理和測定分析按照國家標準方法中規定的進行[14-20]。

1.4數據統計分析

利用SPSS19.0軟件進行統計分析，當P<0.05為具有顯著差異。

2　結果與分析

2.1最佳接種量

以未接種的空白試管為對照，測定各個接種量下的空白試管和標準試管的吸光值(見表1)。通過比較發現，隨著接種量的增加，空白試管和標準試管的吸光值增加，但是在接種量小于1%時，這種變化沒有顯著差異，接種量高于1%時，空白試管的吸光值變大，因此0.25%，0.5%，1%的接種量最合適，為保險起見，選0.5%做為最佳接種量。

表1　不同接種量下煙酸、泛酸、葉酸、生物素空白管和標準管的吸光值

2.2冷凍時間對活菌數的影響

圖1顯示，隨著冷凍時間的延長，活菌數不斷減少，測定煙酸的冷凍菌種表現得最為明顯，它在一開始急劇下降，2個月后穩定存在。-20 ℃冷凍保藏8個月后，植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的活菌數仍能達到107CFU/mL以上，但明顯的是，植物乳桿菌的活菌數從開始就比鼠李糖乳桿菌多。我們也同時做了測定煙酸冷凍菌種的-70 ℃和-20 ℃凍存的比較，8個月時，-70 ℃保存的冷凍菌種活菌數仍能達到9×108CFU/mL，而-20 ℃保存的冷凍菌種活菌數只剩下1.8×108CFU/mL。由于-70 ℃冰箱并不常用，有條件的實驗室可以優先選擇-70 ℃保存。

圖1　冷凍菌種8個月內的活菌數變化Fig.1　Change of CFU incryopreserved cultures during eight months

2.3不同時間下冷凍菌種標準曲線的變化

利用同樣的冷凍菌種，在8個月內進行了8次標準曲線測定分析(見圖2)。結果顯示，冷凍菌種對煙酸、泛酸、葉酸和生物素有高度的特異性與依賴性，隨著標準濃度的增加，試管中的溶液渾濁度隨之增加，但在高點時增加趨勢減少。冷凍菌種具有和新鮮菌種同樣的靈敏度。并且，在8個月內，冷凍菌種具有高的穩定性和重復性。

圖2　利用冷凍菌種進行微生物法分析的標準曲線在8個月內的變化Fig.2　Change of standard curve for microbiological assay with cryopreserved cultures in eight months

2.4冷凍菌種和新鮮菌種標準曲線的對比

分別取冷凍菌種和新鮮菌種的8次標準曲線各標準點吸光值的平均值做成標準曲線，進行比較。新鮮菌種與冷凍菌種的標準曲線有很高的相似性，二者泛酸的標準曲線是重疊的，煙酸和生物素的標準曲線也高度一致，葉酸的標準曲線在高點時，冷凍菌種的生長稍有點低。

圖3　冷凍菌種和新鮮菌種標準曲線的對比Fig.3　Comparison of standard curve with cryopreserved and fresh cultures

2.5樣品測定結果

如表2所示，利用冷凍保藏的菌種和傳代培養的新鮮菌種同時進行6種樣品的分析，重復測定6次，實驗數據用χ±s表示，t檢驗法檢驗，結果表明，采用兩種方法測定的6種樣品含量相一致，沒有顯著的差異(P>0.05)。

3　討論

用同樣的方法制備測定維生素B12的萊士曼氏乳桿菌的冷凍保藏培養液，但是發現冷凍后的活菌數很低，這種方法不適合于萊士曼氏乳桿菌。在GROSSOWLCZ和ORTIZ-ESCOBAR二者的方法中，冷凍菌種保藏液使用之前，要用生理鹽水洗去其中殘余的維生素。我們測定了保藏液中的維生素含量，發現已經完全消耗掉了，因此不必清洗，直接使用即可。

采用微生物分析法測定維生素至今已有60年左右的歷史，因為它的成本低，可操作性強，靈敏度高，在我國現行的國家標準中依然用來測定嬰幼兒食品和乳品中的生物素、泛酸、葉酸、維生素B12、煙酸以及食品中的維生素B6、維生素B12、煙酸、泛酸、葉酸。國標中規定的接種方式依然是傳統的連續傳代接種，測定周期一般是4～5 d，而直接低溫保藏菌種在適宜的培養基中，使得菌種可以快速利用，大大節省測定周期，2～3 d就可以得到結果。由于冷凍保護的菌種在-20 ℃可以穩定至少8個月以上，這樣方便實驗室進行統一的標準化分析，可以簡化分析程序，不會因為菌種活力問題引起測定結果的差異性。冷凍保護的菌種制備技術簡單，在短時間內能夠制備豐富的菌種，可以利用8個月以上。最重要的是，一批冷凍菌種的生長曲線在8個月內比較穩定，而新鮮菌種在轉接過程中可能會出現未知的一些問題，導致標準曲線不穩定。

表2　利用冷凍菌種和新鮮菌種測定樣品的結果

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Use of cryopreserved cultures for microbiological assay of soluble-vitamins in food

LI Quan-xia1，CUI Ya-juan1,2*，CHEN Zhao-tian1，ZHANG Ji-mi1，XU Jia-jia1，LIU Yu-feng1

1(Analysis Laboratory of Beijing Nutrition Resources Institute, Beijing 100069, China) 2(College of Agriculture and Biotechnology of China Agriculture University,Beijing 100193,China)

A simple procedure for preparing glycerol-cryopreserved cultures has been developed. The stability and repeatability of cryopreserved cultures have been studied by measuring the standard curve and colony-forming units. The results revealed that there were more than 107CFU/mL in cryopreserved cultures stored at -20℃ for 8 months. Standard curves of nicotinic acid, pantothenic acid, folic acid and biotin determined using cryopreserved cultures were highly consistent with those from traditional method. There were no significant differences among the results of six samples that determined with cryopreserved and fresh cultures at the same time. Cryopreserved cultures were stable, convenient, fast, and suitable ready source of inoculum.

microbiological method;nicotinic acid;pantothenic acid;folic acid;biotin

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601011

碩士、助理研究員(崔亞娟副研究員為通訊作者,E-mail：cuiyj66@163.com)。

北京市科技計劃項目(Z141100002614013)

2015-03-02，改回日期：2015-06-10