Box-Behnken優化富硒豆芽處理條件

王宏,溫冬玲，馬生健

(嶺南師范學院 生命科學與技術學院,廣東 湛江,524048)

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Box-Behnken優化富硒豆芽處理條件

王宏,溫冬玲，馬生健*

(嶺南師范學院 生命科學與技術學院,廣東 湛江,524048)

以有機富硒液體肥為硒源，對豆芽的富硒培育條件進行優化研究。選擇熱燙溫度、熱燙時間、有機富硒濃度和浸泡時間作為優化因素，研究各因素的不同水平對富硒豆芽發芽率和硒含量的影響。通過單因素試驗和box-behnken設計得出了豆芽富硒處理的最佳條件。結果表明：最佳處理條件為熱燙溫度49 ℃、熱燙時間為10 min,有機富硒濃度為3.5×10-4mg/mL，浸泡時間為6 h，在此條件下富硒豆芽的實測發芽率達到最大值為97.96%，相應地硒含量為14.893 μg/g。

有機富硒液體肥；box-behnken；發芽率；硒含量

硒是人體必需的微量元素之一。硒元素不僅是多種酶的構成成分，同時具有抗氧化、調節甲狀腺激素水平、維持正常免疫、預防克山病和大骨節病等作用，還具有抗腫瘤、維持正常生育功能、保護視力、拮抗汞毒等多種生理功能[1]。硒分為無機硒、有機硒。硒鹽的毒理分析表明，無機硒均為劇毒，過量攝入硒會導致急、慢性中毒，一般僅用于醫藥品而不用于食品，其使用范圍和劑量都受到限制。有機硒是生物體通過代謝過程將環境中的無機硒通過與體內的生物大分子相結合形成含硒有機物，與無機硒相比，其毒性小而生物活性高[2-3]。

利用無機硒浸泡可顯著提高豆芽的硒含量，但由于無機硒的使用存在安全隱患，因此生產上很難推廣使用。當前市場上已有使用較安全的有機硒肥，并在多種作物上應用具有較好的富硒效果，但目前鮮有有機硒肥應用于豆芽上的富硒效果研究。故本研究選擇有機富硒液體肥為硒源，選擇對硒有一定富集能力，而又為消費者經常食用的豆芽菜為對象。

在豆芽的生產過程中品種篩選和籽粒精選是決定著芽苗菜的產量與品質的內因，燙種、浸種和栽培是外因。普通的浸泡、萌發工藝生產富硒豆芽常常遇到萌發率不高、產量不高、富硒效果不佳、質量不佳和爛根等問題[4]。植物種子萌芽是一個較復雜的生物學過程，通過合理科學的種子熱燙處理可提高種子發芽率并提高產量等。熱燙處理主要是在一定溫度下對種子進行水浴熱處理，使種皮的透性增大，氧氣可以順利進入，從而使種子內的代謝活動加強，促進三大貯藏物質的分解，達到促進種子生長的目的[5]。本文主要研究熱燙、浸種處理及有機富硒濃度對富硒豆芽發芽率和硒含量的影響，并采用響應曲面法中的Box-behnken對影響豆芽發芽率和富硒含量的不同處理條件(熱燙溫度、熱燙時間、有機富硒濃度、浸泡時間)及其相互作用進行研究，從而得出最佳富硒豆芽生產處理條件。

1　材料與方法

1.1試驗材料

大豆:當年產的東北大豆(購買于廣東省湛江市赤坎區信和超市)，挑選籽粒飽滿，無爛或蟲蛀的大豆做實驗。

1.2 試劑與儀器

1.2.1試劑

綠維康牌有機富硒肥，楊凌奧邦生物科學有限公司生產。產品登記證號：農肥(2008)準字1755號。執行標準: NY1428-2010)。

硒標準儲備溶液，于湛江市赤坎區步行街康百公司購買，濃度1 000 μg/mL；硒標準使用液：1.568 μg/mL。

EDTA溶液、KI溶液、醋酸鈉溶液(NaAc)、HCl、可溶性淀粉、結晶紫溶液。

1.2.2儀器

HPX-9052ME數顯電熱恒溫培養箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；721分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；AUY200精密電子天平，四川成都科恒達儀儀器設備有限公司；GZX-9140MBE型數顯鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；DFY-200型手提式高級中藥粉碎機，青州市三寶中藥機械廠。

1.3富硒豆芽工藝流程

黃豆→沖洗→燙種→浸種→萌發(催芽)→采收

1.4單因素試驗設計

參照文獻[5-9]中的富硒豆芽的處理方法，確定富硒豆芽的基本處理條件分別為，熱燙溫度為50 ℃、熱燙時間4 min、浸泡時間6 h。經過初步預實驗與富硒食品含硒量標準[12]確定有機富硒濃度為1×10-4mg/mL，在此基礎上設計單因素試驗。

1.4.1不同熱燙溫度對大豆發芽率和硒含量的影響

分別稱取6份100 g的大豆洗凈后分別置于大燒杯內，按以下方法進行處理：將大豆分別在40、45、50、55、60 ℃溫水中燙4 min，然后將處理好的大豆用1×10-4mg/mL綠維康有機富硒液體肥溶液在25 ℃培養箱中浸泡6 h，待浸泡完后，將種子置于底鋪紗布的帶孔塑料圓盤中，上蓋紗布于25 ℃的恒溫培養箱中進行培養4 d，每隔12 h噴灑10 mL的蒸餾水。觀察培養箱內培養24 h的大豆發芽情況，硒含量采用分光光度計進行測定[10]。比較熱燙溫度對發芽率和硒含量的影響，確定有利的熱燙溫度，以未處理的樣品做對照。

1.4.2不同熱燙時間對大豆發芽率和硒含量的影響

操作方法同1.4.1，改變燙種時間，分別為2、4、8、16、32 min，比較熱燙時間對大豆發芽率和硒含量的影響，以未處理的樣品做對照。

1.4.3有機富硒濃度對大豆發芽率和硒含量的影響

操作方法同1.4.1，其他條件保持不變，將大豆分別置于不同濃度的綠維康有機富硒肥溶液中浸泡，分別為1×10-4、2×10-4、3×10-4、4×10-4、5×10-4mg/mL,根據我國富硒食品硒含量標準[11]以及人每天推薦攝入硒含量確定較適宜的濃度，以未處理的樣品做對照。

1.4.4浸泡時間對大豆發芽率和硒含量的影響

操作方法同1.4.1，在其他因素不變的條件下，分別浸種3、6、9、12、15 h。確定大豆富硒的最佳浸泡時間，以未處理的樣品做對照。

1.5實驗指標的測定

1.5.1發芽率的測定[6]

發芽率是指經過浸泡、萌發處理后，樣品中發芽的大豆數量占樣品中大豆總數的百分比。發芽率的測定方法為，從每份萌發好的大豆樣品中隨機取出3份小樣，每份小樣的大豆總數在30～50粒之間，計數每份小樣中發芽與不發芽的大豆數，即可計算該份小樣的發芽率，然后用3份小樣發芽率的平均值來代表整份大豆樣品的發芽率。大豆發芽的判定標準為伸出大豆種皮的胚根長度大于1 mm。

1.5.2豆芽硒含量測定[10]

1.5.2.1實驗原理

利用濃HNO3的強氧化性，將硒氧化成四價，四價硒與I-在酸性介質中得到體積較大的I3-離子與結晶紫大陽離子形成有色締合物。用分光光度計測定硒(IV)-KI-結晶紫體系吸光度值，應用對照法測定豆芽中硒含量。

1.5.2.2樣品處理

取培養結束的豆芽用蒸餾水沖洗，烘干，取出，研成細末，置干燥器中備用。取細粉1.000 g，精密稱定，置100 mL燒杯中。加入10 mL濃HNO3浸泡12 h后加熱蒸發浸取液近干稍冷，加1 mL H2O2,在稍加熱，冷卻后濾去殘渣，濾液置于250 mL容量瓶中，用純凈水定容，作為待測液。

1.5.2.3硒含量測定

取編號為1、2、3三只25 mL容量瓶，移取1 mL硒標準液于2號瓶中，移取1 mL以處理好的樣品液于3號瓶中，在3只容量瓶中均依次加入9 mL HCl、2.5 mL KI、2 mL NaAc、2 mL淀粉溶液、2 mL結晶紫，以水定容，搖勻。配好溶液穩定10 min后，用1 cm比色皿，在波長544 nm處以1號瓶溶液為參比液測定吸光度值，硒含量(X)記錄。

式中:A樣，樣品的吸光度值； A標，硒標液的吸光度值；c標,硒標準溶液溶度μg/mL；m,樣品質量g；V,定容后濾液體積，mL。

1.6Box-behnken實驗設計

根據上述的單因素試驗結果，采用Design-Expert 8.0.5軟件，分別選擇單因素實驗中的4個不同因素的3種不同水平進行優化實驗。以熱燙溫度(℃)(X1),熱燙時間(min)(X2)、有機富硒濃度(10-4mg/mL)(X3)、浸種時間(h)(X4)為主要考察因素，因素水平設計見表1。

1.7數據處理

每個樣品試驗重復3次，取平均值。采用Excel 2007和Design-Expert 8.05進行設計和分析，數據采用方差(ANOVA)，當P<0.05時表示差異性顯著，P<0.01表示極顯著。

表1　Box-behnken實驗因素水平編碼

2　結果與分析

2.1單因素實驗結果與分析

2.1.1熱燙溫度與時間對大豆發芽率和硒含量的影響

如表2所示,與未熱燙處理的大豆相比較，在熱燙溫度40～50 ℃內，隨著溫度的升高，大豆24 h發芽率與硒含量都呈現增加趨勢，但溫度為60 ℃，發芽率明顯下降，大豆硒含量也減少，原因是溫度過高，對大豆造成器質上的傷害[12]。當熱燙溫度為50 ℃ 時，隨著熱燙時間的延長各項指標呈現先升高后降低的變化，當熱燙時間為8 min時，發芽率最高，硒含量也較高。這說明熱燙時間過短，對大豆的刺激不夠，生長緩慢，吸收硒溶液較慢。但熱燙時間過長，大豆無氧呼吸增強反而會喪失部分發芽能力，抑制種子的萌發，也在一定程度上影響其硒溶液的吸收。

表2　熱燙溫度與時間對大豆發芽率和硒含量的影響

2.1.2有機富硒濃度與浸泡時間對大豆發芽率和硒含量的影響

從表3可以看出，用有機富硒肥浸泡的大豆的發芽率明顯高于未處理組，而且發芽率與硒含量隨著濃度的增大而增大，含硒量是未處理組的10多倍。說明有機富硒肥可以縮短大豆發芽時間，提高發芽率，還能顯著提高大豆的硒含量，達到很好的富硒效果,與有機富硒肥產品功能介紹相符。隨著浸泡時間的升高，大豆在24 h發芽率呈現先升高后降低的趨勢，說明長時間浸泡，大豆無氧呼吸增強反而會喪失部分發芽能力，抑制種子的萌發。硒含量在3～9 h是不斷增加的，增加的幅度較大，而在12～18 h時變化不大。說明浸泡時間到一定程度時，大豆吸收硒溶液達到了一個飽和狀態。

表3　有機富硒濃度與浸泡時間對大豆發芽率和硒含量的影響

2.2Box-behnken設計優化實驗結果與分析[13-14]

根據試驗因素和水平的設計，采用不同的熱燙溫度、熱燙時間、有機富硒濃度和浸泡時間處理大豆，利用Design-Expert 8.0.5軟件共進行了29次實驗，并分別對大豆發芽率和硒含量進行評定。實驗設計和結果見表4。

表4　實驗設計與結果

通過析因實驗和中心試驗，以析因點為自變量取值在熱燙溫度X1，熱燙時間X2、有機富硒濃度X3和浸泡時間X4所構成的三維頂點，零點為區域的中心點，中心點試驗5次，用以估計試驗誤差。對所得數據進行回歸分析，回歸分析結果見表5。

由表5知，大豆發芽率模型(P<0.000 1)達到極顯著水平，且有很好的確定系數。方差分析中，熱燙溫度(X1)、熱燙時間(X2)、有機富硒濃度(X3)和浸種時間(X4) 對大豆發芽率影響是顯著的(P<0.05)。

表5　大豆發芽率響應曲面二次模型的方差分析

注：P<0.05顯著，P<0.001極顯著。

回歸診斷顯示，多元相關系數(R2)=0.975 1，表明方程擬合度和可信度較高。失擬項P=0.219 9>0.05不顯著，表明可用二次回歸方程模型代替試驗點對試驗數據進行分析。綜上，該回歸模型可用于大豆發芽率的響應值預測。

根據Design-Expert 8.05軟件得到的二次回歸方程如下：

發芽率/%=+96.24-4.12X1-1.89X2+1.41X3-2.15X4-2.37X1X2-1.18X1X3-2.36X1X4-0.26X2X3-1.84X2X4-0.45X3X4-5.83X12-3.12X22-1.94X32-1.02X42

硒含量=+9.10-0.17X1-0.034X2+1.66X3+0.18X4-0.19X1X2-0.14X1X3-0.011X1X4-0.064X2X3+0.17X2X4-0.23X3X4-0.55X12+8.708E-003X22+0.37X32-0.18X42

根據實驗設計與結果，可由Design-Expert 8.05軟件得到圖1。

圖1　各種因素對大豆發芽率的交互影響Fig.1　Effect of interaction of each fators on germination rate of soybeans

圖1為各個因素之間的相互作用對大豆發芽率的影響。從圖1-a可以看出，熱燙溫度和熱燙時間對大豆發芽率的影響是顯著的。在一定的熱燙時間下，隨著熱燙溫度的上升，發芽率呈現先增大后降低，曲面坡度變化較大，在接近50 ℃時，達到最大值。熱燙溫度一定時，發芽率隨著熱燙時間的延長也呈先增大后減少趨勢。

圖1-b顯示，熱燙溫度和有機富硒濃度對大豆發芽率的影響是顯著的。熱燙溫度在上升過程中，大豆發芽率先增加后減少，當熱燙溫度為50 ℃左右時，發芽率達到最大值；有機富硒濃度不斷上升過程中，大豆發芽率也不斷增加，曲面坡度比較陡。圖1-c、圖1-d同理進行分析得出浸泡時間與熱燙溫度，熱燙時間之間都存在一定的相互作用。

2.3模型優化和驗證

通過對二次回歸模型的分析，在設定大豆發芽率最大的前提下，以硒含量為指標，確定富硒豆芽最佳處理條件見表6。

表6　富硒豆芽的優選理論工藝參數

綜合以上分析結果，采用優化的富硒豆芽處理條件進行富硒豆芽的評定驗證試驗，熱燙溫度為49 ℃，熱燙時間為10 min，有機富硒濃度為3.5×10-4mg/mL，浸泡時間為6 h，重復試驗3次，結果取3次的平均值。豆芽發芽率為97.96%，硒含量為14.893 μg/g，這表明理論值和實際值之間具有良好的擬合性，優化模型可靠。

3　結論

本試驗利用Box-behnken對富硒豆芽的處理條件進行了優化，確定最佳處理條件為熱燙溫度49 ℃，熱燙時間為10 min,有機富硒濃度為3.5×10-4mg/mL，浸泡時間為6 h，在此條件下富硒豆芽的實測發芽率達到最大值為97.96%，相應地硒含量為14.893 μg/g.

中國營養學會推薦的成年人硒攝入量為50～250 μg/d[12]，依照經過3.5×10-4mg/mL有機硒溶液處理后豆芽含硒量及我國的RDA標準，成人每天只需攝入15 g該富硒豆芽就能滿足中國營養學會的RDA標準。由于有機硒容易被吸收，如果按照人每天攝入量100 g計算，則浸泡處理大豆的有機硒濃度將要更低。

本文對豆芽進行富硒處理就是其中一種富硒產品。而對豆芽富硒處理可以采用浸泡和噴灑的方式，而本論文實驗對豆芽采用的是有機硒濃度浸泡的方式，噴灑方式對硒含量的影響有待進一步研究。

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Optimization of the processing conditions of the selenium-enriched bean sprouts with box-behnken design

WANG Hong, WEN Dong-ling， MA Sheng-jian*

(Life Science and Technology School，Lingnan Normal University，Zhanjiang 524048,China)

This paper optimize the cultivation conditions of selenium-enriched sprouts by taking selenium-rich liquid fertilizer as organic selenium source. Blanching temperature, blanching time, concentration of selenium fertilizer and soaking time were selected as the factors in optimization, the effect of different factors to the germination rate and selenium content of selenium-enriched bean sprouts were studied. The optimum processing conditions for selenium-enriched bean sprouts were determined by single factor experiment and Box-behnken design. The results showed that the best conditions were: blanching temperature 49 ℃, blanching for 10 min, at selenium fertilizer 3.5×10-4mg/mL, soaking for 6 hours. Under the above conditions, the maximum germination rate was 97.96% and selenium content of selenium-enriched bean sprouts was 14.893 μg/g.

organic elenium-riched liquid fertilizer； box-behnken； germination rate； selenium content

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601021

碩士，副教授(馬生健副教授為通訊作者，E-mail：mashengjian1@163.com)。

國家星火計劃資助(2013GA780088)；湛江市熱帶特色資源植物技術開發重點實驗室項目(2014A06008)

2015-04-29，改回日期：2015-09-16