牛奶加工單元操作（四）
——牛奶的熱殺菌

文/顧佳升

（上海奶業行業協會）

牛奶加工單元操作（四）
——牛奶的熱殺菌

文/顧佳升

（上海奶業行業協會）

1　牛奶細菌的來源

牛奶在健康的乳房里生成之初是無菌的，但是在擠出來之前也有可能被存在于空氣、土壤等外部環境里的細菌污染。細菌很小，表觀直徑約為0.6 μm，比脂肪球小多了（圖1）。

除非擠奶操作，平時乳房的乳頭管被括約肌所封閉，牛奶不會漏出來，但是密封得并不完全嚴密，微小的細菌可以“鉆”進去。因此在乳房乳頭管里的牛奶實際上并不是無菌的（圖2）。

侵入牛奶的細菌都是不速之客，其中大部分能夠在牛奶里生存并進行繁殖，也有少數細菌因不適應而死亡。為了研究牛奶里的細菌，我們采用了許多微生物學的專業術語，“細菌總數（TBC）”是其中最常用的一個。其含義是當牛奶樣品接種到標準配方的營養瓊脂平板上后，在有氧氣存在的情況下，經過37 ℃、48 h培養，肉眼能夠看見的由細菌生長形成的菌落數量；菌種不同，菌落的形態可能不盡相同，但有一個算一個。有時也稱其為“菌落總數”，或者“雜菌數”。

圖1　細菌與乳脂肪球大小的比較

理論上來說，接種到平板上的每一個細菌個體都有可能通過競爭，在培養的過程中獲得營養而生長，形成一個個來自同一母體細菌的菌株群，每個菌株群包含著數量巨大的細菌個體。控制合適的樣品接種濃度，可以得到相互不重疊的由單個細菌形成的菌株群。人的肉眼所見的菌落，均是超過10 萬個以上細菌所形成的菌株群。菌株群就是我們所說的菌落。一個菌落表示為1 CFU，常用的細菌總數單位是每毫升或每克牛奶里的CFU數，表示為“CFU/mL”或“CFU/g”。以在同等條件下計數得到的測試結果作為一個相對標準，可以從總體上來判定牛奶被環境細菌污染的程度。

擠奶操作實踐告訴我們，無論是機器擠奶還是人工擠奶，在開始擠奶時都需要手工把最初“三把奶”廢棄掉，以便讓后續無菌的牛奶將乳頭管沖洗干凈。即使如此，還是難以防止來自外部環境的細菌進入牛奶。據測定，在一般控制的衛生條件下，剛擠出來的牛奶細菌數一般在300～3 000 CFU/mL。

一個重要的事實是牛奶自身有“自然抑菌期”，意思是即使不作任何處理，入侵到剛擠出來牛奶里的細菌在這個階段里也不會生長。表1展示了牛奶擠出之后的細菌總數變化，可以看出，在生牛奶擠出之后的5 h里，細菌生長受到了明顯抑制，這也是生牛奶品質的“黃金期”。而生牛奶是世界上制作“生奶制品（Raw Milk Product）”的唯一原料，其中最大宗的產品就是高度成熟的奶酪。至于足夠新鮮的生牛奶能夠“抑菌”的確切原因，雖然有許多說法，但至今仍不甚明了。

另一個更重要的事實是：過了自然抑菌期，牛奶里的細菌將以平均每20 min翻一番的速度增殖，即以2n的倍數迅速增加。假定初始時牛奶里只有1 個細菌，2 h后將成為128 個，不到7 h就成上百萬之勢了，因此牛奶將迅速變質腐敗。盡管牛奶中的大部分細菌并不是致病菌，但是只要混雜了少量人畜共患的致病菌，直接喝生牛奶都將是一件非常危險的事，而且變質腐敗后的牛奶失去了誘人的滋味和氣味。

擠出來的牛奶帶著奶牛的體溫，為38 ℃，其可靠的自然保存時間只有4～6 h。牛奶階段性的自我保護能力被稱之為“自然抑菌（Germicidal）”作用，其客觀效果是保證了奶牛作為一個物種能夠在自然界不斷繁衍，同時也為人類商業化利用牛奶提供了可能性。但是自然抑菌期實在太短了，導致加工規模無法做大。是否有辦法延長抑菌的周期呢？經過探索，發現牛奶在擠出之后如果立即冷卻，可以有效延長抑菌時間，圖3展示了不同冷卻儲存溫度下牛奶細菌的增殖情況。

不過儲存溫度不能降到牛奶的冰點以下，因為凍結會傷害牛奶里的活性營養成分。通常，在0～10 ℃溫度下儲存36 h，細菌總數可以控制在30 萬CFU/mL以下，這是制備符合國際標準奶制品的最低要求。因此，從牛奶擠出到投料加工的“36 h”是商業化利用牛奶的“黃金期”。處于“冷鏈”保護之下的生牛奶，是制作各類“奶制品（Milk Product）”無可替代的重要原料，同時生牛奶的“36 h”商業黃金期也是制約乳品企業建設規模的一個繞不過去的約束條件。

圖2　健康乳房內初始細菌的分布

表1　牛奶擠出之后的細菌總數觀察報告單位：CFU/mL

由此，全世界牛奶加工者形成了一個基本共識：牧場是加工廠的第一車間，而且加工廠不宜建設得太大，以致遠離了牧場。這是因為牛奶的抑菌作用只是抑制細菌的增殖，并沒有殺滅細菌的效力，更沒有破壞細菌新陳代謝產物的能力，而細菌的代謝產物富含分解牛奶各種成分的酶，在很多情況下將導致牛奶加工的失敗，從而無法保證奶制品的質量。而且一旦混雜有致病菌，其代謝產物還含有毒素，由于加工過程沒有能力消解這些毒素，因此必將無從保證奶制品的安全。這是人們非常注重生牛奶的質量，嚴格防止細菌入侵和在其中繁殖的根本原因，也是重視奶源基地建設的根本原因。

圖3　在不同冷卻儲存溫度下牛奶細菌的增殖情況

2　牛奶細菌的分類

細菌分類是普通微生物學研究的內容。《伯杰氏鑒定細菌學手冊（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）》（1923年出版）中的分類法是國際上公認的科學權威的方法。它是按生物學普遍適用的原則，主要根據細菌的特征來進行分類的一種方法，將細菌系統地分成科、屬、種，當然完全適用于牛奶里的細菌。但是從牛奶加工業的實際出發，在實踐中更多采用的是按照其它原則確立的分類法。其中之一是依據細菌對牛奶不同成分的作用而分類的一種體系，還有是按照不同“細菌生長溫度”分類的第二種實用體系，第三種分類法是針對傳染病專用的致病菌，尤其是傳染人畜共患疾病的致病菌。

根據對牛奶不同成分的作用而分類的方法，是比較容易理解的。由于牛奶的主要成分是蛋白質、脂肪和乳糖，因此將細菌分別分類為蛋白質分解菌、脂肪分解菌和乳酸菌。這種分類法不僅為消除有害菌指明了方向，也為篩選有益菌和專門的發酵菌提供了方向。

圖4　細菌生長的溫度范圍

圖5　按適宜生長溫度對生牛奶細菌的分類系統

另外，有必要對“細菌生長溫度”分類的方法加以簡單說明。所謂“細菌生長溫度”，是指每種細菌只能在一定溫度范圍里生長，超越了該范圍，細菌將不能繁殖，甚至死亡（圖4）。對于不同細菌的生長溫度，牛奶加工業中普遍采用的具體標準如下（圖5）：適宜生長溫度低于7 ℃的是耐冷菌（Psychrotrophic），7～20 ℃的是嗜冷菌（Psychrophilic），20～45 ℃的是嗜溫菌（Mesophilic），45～70 ℃的是嗜熱菌（Thermophilic），高于70 ℃的是耐熱菌（Thermoduric）。

對于耐熱菌株來說，在更高溫度下才可能停止繁殖和生長，它們有一種特殊的本領，即變成耐受力極強的芽孢體，一旦生存環境恢復，它們也就恢復了繁殖力。對于嗜冷（Psychrophilic）或嗜溫（Mesophilic）菌株來說，在更低溫度下，盡管不是適宜的生長溫度，但仍具有一定的繁殖能力。在這個分類體系中，我們應該高度關注其中的兩端，一端是耐冷菌（Psychrotrophic）的活動，因為一般認為這是儲存牛奶的安全溫度，另一端是耐熱菌的耐受力，因為一般認為這是殺滅細菌的安全溫度。

3　牛奶熱殺菌的分級處理

如前所述，牛奶一旦從奶牛身上擠出而失去了乳房的保護之后，非常容易遭受環境中以細菌為主的微生物侵襲，而且微生物中難免伴有多種致病菌，尤其是傳染人畜共患疾病的致病菌。對于城鎮居民而言，直接飲用生牛奶，包括未經熱殺菌的奶制品如稀奶油等，都具有很高的風險。因此為了食品安全，采用適當的工藝技術對牛奶及其制品進行殺菌處理是必不可少的。而在超聲波、紫外線、微波、輻照、高壓等多種殺菌方法中，獲得商業上普遍使用的，還只是以熱水和水蒸汽為熱源的傳統熱處理方法。

細菌總數的檢測能夠判斷環境細菌污染牛奶的相對程度，但是不能提供環境細菌的分類信息，也沒有是否含有致病菌的任何信息。根據長期以來人類消費牛奶的經驗，一旦牛奶細菌總數超過10 萬CFU/mL，致病菌存在的概率就達到了足以威脅人們健康的程度。牛奶中致病菌研究的結果見表2。

1856年，法國科學家路易·巴斯德（Louis Pasteur）在人類歷史上第一次提出了保證安全飲用牛奶的“巴氏消毒法”：溫度為145～150 ℉（相當于62.8～65.6 ℃），保持30 min。同時他還指出：若不足145 ℉則毒菌未能殺盡，若超過150 ℉則毀損牛奶活性成分，導致滋養全失。所謂“毒菌”是當時的說法，現在應該理解為致病菌。巴氏消毒法自1895年起得到了商業化大規模應用。一個半世紀以來的實踐，充分證明了這個方法對保證安全飲用牛奶的可靠性。

表2　生牛奶中常見的致病菌及其熱死點

目前微生物學對殺菌規律的研究已經非常成熟了。人們發現不管采用哪種殺菌方法（如化學法、射線輻照法、加熱法），一次殺菌操作的結果是只能按某一比例殺死部分細菌，并不是全部。如果將殘存下來的細菌再次采用同樣的方法進行第二次殺菌，結果仍是按同一比例殺死部分細菌，并不是全部。殺菌比例越大，意味著所采用殺菌方法的強度越強。所謂殺菌強度，在化學法里是指化學品濃度和作用時間的組合，在放射輻照法里是指放射源強度和輻照時間的組合，在加熱法里是指加熱溫度和在該溫度下保持時間的組合。

殺菌規律不僅已經由細菌總數的檢測給出了證明，而且人們也總結出了經驗公式。前面的內容中提到過細菌增殖速度為指數2n的倍數，而細菌的殺菌規律也服從對數規律，殺菌效率的數學表達式是：

殺菌率（%）=1 0 0%× （LogN0-LogNt）/LogN0

其中：N0—投料時牛奶的初始細菌總數；

Nt—經過保持時間為t的一次殺菌后，牛奶的殘存細菌總數。

一般情況下，生牛奶里的芽孢數量非常有限，不足以威脅健康。經巴氏消毒處理后，致病菌都被殺滅了；在冷藏條件下存儲數天，巴氏消毒牛奶的細菌總數不會超過3 萬CFU/mL，不足以改變色香味的程度。換而言之，63 ℃、30 min或72℃、15 s的熱處理強度，足以保證牛奶及其制品的安全性和優良品質了。

但是對于長保質期的奶制品，例如無須冷藏保存的滅菌牛奶，巴氏消毒的熱處理強度顯然還是遠遠不夠的。一方面是因為芽孢保留著繁殖能力，常溫條件下在長達數個月時間里，完全可能增殖到足以威脅公眾健康的程度；另一方面，牛奶中還依然存在其它耐熱的非致病菌，哪怕只有幾十 CFU/mL的殘留，它們將繼續利用牛奶的營養而快速生長；還有，無論是牛奶里原來存在的酶，還是由細菌活動而產生的酶，它們大多數具有耐熱性，巴氏消毒雖然能夠殺滅大部分細菌，但不足以抑制和鈍化酶的活性。總之，在長長的保存期內，殘留的細菌和保留活性的酶將繼續活動，從而顯著改變牛奶的味道和質地。對于長保質期的奶制品來說，需要更強更徹底的熱處理。

然而，隨著熱處理強度的提高，在殺滅更多細菌的同時，也會引發牛奶內部成分許多復雜的化學變化，從而引起牛奶色香味的顯著變化。20世紀70年代之前，人們認為牛奶里的不少營養成分雖然對熱敏感，例如維生素等物質受熱容易發生變化、蛋白質與乳糖會發生美拉德反應而出現“焦糖化”現象，但是所有這些變化，似乎與其它食物所發生的變化一樣，都很尋常。然而現在的認識有了很大的改變。新發現的證據表明，隨著牛奶滅菌強度的提高，美拉德反應的深度發展會產生有毒有害物質，如羥甲基糠醛等。因此，國際上將傳統的“牛奶對熱敏感”說法，修正為“防止熱傷害牛奶”了。主要原因在于牛奶中蛋白質的變化，表現為某些蛋白質自身結構的變化和蛋白質之間的相互交聯變化2 個方面。

人們很早就了解到乳清蛋白受熱后，非常容易發生結構變化，本身的膠體狀態變得很不穩定，例如雞蛋清投入熱水中立即就發生絮凝。但是牛奶中的乳清蛋白似乎要穩定得多，即使加熱到100 ℃以上，也不至于出現明顯的絮凝。其實牛奶中的乳清蛋白也同樣發生了變化，只不過牛奶中的乳清蛋白在絮凝之前，已經與牛奶中的酪蛋白發生了交聯反應。這雖然避免了絮凝的發生，但是乳清蛋白發生了更為復雜的結構性變化。例如，由162 個氨基酸組成的β-乳球蛋白結構里含有2 個“分子內雙硫鍵（-S-S-）”和1個游離的硫氫鍵（-SH）。溫度上升到65 ℃之后，β-乳球蛋白氨基酸鏈的空間構象將發生偏轉位移（蛋白質變性）。隨著溫度升高，原來處在內部位置上的硫氫鍵基團和雙硫鍵基團開始外露，并且部分發生斷裂和重組，形成H2S，即硫化氫分子。然后，β-乳球蛋白顆粒的膠體狀態被破壞，相互聚集引起沉淀。雞蛋清投入熱水立即就發生明顯絮凝的原因也在此。

圖6　溫度/時間與β-乳球蛋白變性率之間的關系曲線圖

圖7　加熱溫度與游離-SH基團的關系曲線

進一步研究得出了圖6“溫度/時間與β-乳球蛋白變性率之間的關系曲線”和圖7“加熱溫度與游離-SH基團的關系曲線”，分別顯示了熱處理強度與β-乳球蛋白變性率和游離-SH基團之間的數量關系。

但是在牛奶加熱的過程中，我們并沒有看到β-乳球蛋白沉淀的發生，而且在飲用牛奶時也感覺不到硫化氫的異味。看不到變性β-乳球蛋白發生沉淀的原因，是在沉淀發生之前，變性的β-乳球蛋白“冒充”酶而“粘附”到κ-酪蛋白的第105位和第106位氨基酸的結合點上去了。而這樣的“粘附”既是加工滅菌奶、酸奶等產品獲得成功的技術關鍵，也是導致制作奶酪等產品失敗的一個關鍵，因為凝乳酶的作用點被變性的β-乳球蛋白“粘附”上去而被“屏蔽”了。

至于為什么感覺不到硫化氫所特有的臭雞蛋味，是因為其被溶解在牛奶里的微量氧所氧化了。不過我們依然可以感覺到滅菌牛奶帶有令人不快的“蒸煮味”，當然這是難以接受的。然而，為了得到長保質期的滅菌奶，這種“蒸煮味”卻是必須容忍的。因為變性的β-乳球蛋白“冒充”酶而“粘附”到κ-酪蛋白表面上去，是改善牛奶蛋白質整體熱穩定性的唯一有效辦法。更何況在常溫下保存數周之后，隨著氧化作用的持續進行，“蒸煮味”也會逐步淡化。因此，出于不同的需要，對牛奶的熱處理不僅需要按照強度分級，而且還需要使用一定的技巧和方法。

在熱處理的技巧和方法中，最重要的是讓牛奶在80～90 ℃溫度區間停留一個適當的時間，讓β-乳球蛋白發生適當的變性，并有足夠的時間和機會“粘附”到κ-酪蛋白上去。否則，如果直接快速升溫到130 ℃以上的話，不僅β-乳球蛋白會出現大面積沉淀，連酪蛋白也將發生變性和沉淀。表3列舉了國際奶品聯合會（IDF）認定的4 種熱殺菌工藝中的3 種，因為介于巴氏殺菌和間接法超高溫滅菌之間的“直接法超高溫滅菌”，在我國至今尚無實際應用。

按照國際標準的定義，所謂“熱處理”指的是“強度不低于巴氏殺菌的所有加熱操作方法”，都是以殺滅致病菌為基本目標的。為了研究熱處理之后牛奶里的細菌活動，尤其是致病菌的情況，僅僅使用術語“細菌總數”就顯得不夠了。如前所述，不是牛奶里的所有細菌都能夠在規定的培養條件下生長，例如溫度另有要求的細菌、厭氧的細菌，以及有特殊營養要求的細菌等。如果需要了解這些特定細菌的情況，必須改變培養的條件，或者營養平板的成分，以獲得這些特定細菌的菌落數。

表3　牛奶熱處理強度的分級及其產品特性

不過，致病菌的檢驗需要對各種致病菌的生理特性和生長形態擁有透徹的了解，然后才能提供它們各自合適的生長條件。致病菌種類不少，因此實際操作起來過程非常繁瑣和冗長，完成法定的操作程序，一般需要幾周的時間。只有在必要的情況下才有針對性地按程序進行操作。

在實際控制中，更多地使用另一個微生物學術語“大腸菌群”來判斷致病菌危害的總體可能性。所謂的“大腸菌群”也不是細菌分類學上的規范名稱，不代表某一個或某一屬細菌，指的是具有某些共同特性的一組與糞便污染有關的細菌。大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產氣克雷白氏菌、陰溝腸桿菌等是組成這個群體的主要成員。它們的共同特性是：①經過不低于巴氏殺菌強度的熱處理之后都理應被全部殺滅；②在空氣、水、塵埃等自然環境里普遍存在；③在一定培養條件下能發酵乳糖，產酸產氣。

由于牛奶里絕大部分常見致病菌的熱死條件與大腸菌群非常接近，所以可以由大腸菌群的殺滅程度來估計致病菌是否存在。由上述特性①可知，大腸菌群適合用來判斷熱處理過程是否有效。由特性②可知，大腸菌群適合用來判斷終端產品和中間產品的安全性，這是因為只要經過最低強度的巴氏消毒后，大腸菌群理應不再存在，即致病菌也不再存在，如果還存在，那么只有一種可能：完成殺菌之后，在灌裝、運輸、儲存期間發生了“第二次”污染。總之，如果出現大腸菌群超標，指向的都是致病菌存在的可能。由此可見，檢驗大腸菌群就是給出了一個“指示信號”。特性③則給出了建立檢驗操作方法的途徑。與致病菌的檢驗方法相比，檢驗大腸菌群要簡單易行得多，完成一套法定的操作過程僅需幾天的時間，如果加以改進，檢驗時間還可大幅度縮短，因此，檢驗作為“指示信號”的大腸菌群得到了廣泛應用。

綜上所述：評估生牛奶細菌學質量的主要指標是細菌總數；評估熱殺菌牛奶細菌學質量的主要指標是細菌總數、大腸菌群和致病菌，但有時只用其中的1 個或2 個也足以說明問題。

（未完待續）

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顧佳升（1948-），男，學士，高級工程師，研究方向為乳品加工及檢驗。

2014-11-12）