PPARγ上調大鼠心肌細胞中miR-148b表達不依賴于轉錄水平*

陜西省人民醫院心內一科(西安710068)

趙　娜　張　勇▲　劉小軍　夏東雨　徐姣姣　劉仲偉　潘　 碩　于海奕△

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·論著·基礎研究·

PPARγ上調大鼠心肌細胞中miR-148b表達不依賴于轉錄水平*

陜西省人民醫院心內一科(西安710068)

趙娜張勇▲劉小軍夏東雨徐姣姣劉仲偉潘 碩于海奕△

目的：探討PPARγ是否能上調大鼠心肌細胞中miR-148b表達，以及PPARγ上調miR-148b表達是否依賴于轉錄水平。方法：利用吡格列酮刺激大鼠H9C2心肌細胞PPARγ激動，應用GW9662特異性拮抗大鼠心肌細胞PPARγ激動。采用Real-time PCR法檢測大鼠H9C2心肌細胞中miR-148b表達水平；利用生物信息學方法分析miR-148b啟動子區域的PPARγ結合位點；應用染色質免疫共沉淀法(ChIP)驗證PPARγ是否與miR-148b啟動子結合。結果：吡格列酮劑量依賴性上調miR-148b表達(P<0.01)；吡格列酮上調miRs-148b表達后，給予PPARγ特異性拮抗劑GW9662，上調的miR-148b表達降至對照水平(P<0.01)；生物信息學預測miR-148b啟動子區域存在PPARγ的兩個結合位點；應用ChIP實驗驗證轉錄因子PPARγ不能與miR-148b啟動子區域的兩個預測結合位點結合。結論：PPARγ上調大鼠心肌細胞中miR-148b表達，但調控不依賴于轉錄水平。

主題詞細胞/病理生理學心肌轉錄因子/代謝核糖核苷酸類/代謝動物，實驗大鼠

MicroRNAs(miRNAs)在生物體內廣泛存在，通過調控不同的RNA發揮生物學功能。miRNAs在生理發育及疾病進展中表達發生改變[1]，從miRNAs的生成生物學行為過程分析導致miRNAs表達改變的機制，有助于深入理解miRNAs所參與的病理變化過程。研究發現在哺乳動物細胞中內源性前列環素信號通路能上調miR-148b表達水平[2]。參與內源性前列環素信號通路的分子多種多樣，其中PPARγ是其中的關鍵蛋白分子之一。本研究旨在探索:①PPARγ是否上調miR-148b表達水平；②如果PPARγ上調miR-148b表達水平，是否依賴于轉錄水平。

材料與方法

1大鼠心肌細胞H9C2培養大鼠H9C2細胞購自上海生物化學與細胞生物學研究所，參考文獻方法培養[3]，待細胞融合至90%，更換含有1%胎牛血清的培養基，應用PPARγ激動劑吡格列酮(Pioglitazone)或PPARγ拮抗劑GW9662處理(Sigma-Aldrich, pioglitazone/1～10μmol)。

2實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real time- QPCR)應用miRcute miRNA分離提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取分離小分子RNA(小于200個堿基)。MiRcute microRNA cDNA合成試劑盒及實時熒光定量PCR檢測試劑盒(北京天根生化科技有限公司)用于microRNA表達分析。實時熒光定量PCR采用ABI PRISM 7700檢測系統完成。MiR-148b引物序列為: TCAGTGCATCACAGAACTTTGT；內參5S引物序列為: GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC。

3染色質免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)參考Porro 等方法[4]，于大鼠H9C2細胞行ChIP實驗。應用調整后的RIPA[1%十二烷基硫酸鈉，5mmol乙二胺四乙酸，50mmolTris-鹽酸(pH 8.1)，5%蛋白酶抑制劑cocktail]溶液裂解H9C2細胞，超聲使裂解產物降解成為約200～1000bp大小的DNA碎片。然后用ChIP緩沖液[1% Triton X-100，2mmol 乙二胺四乙酸，150mmol 氯化鈉，20mmolTris-鹽酸(pH 8.1)，5%蛋白酶抑制劑Cocktail]稀釋10倍，然后分別與PPARγ抗體，IgG抗體共孵育，于4℃過夜，加入蛋白A/G瓊脂糖結合抗體-DNA復合物。隨后交聯物質進一步于65℃孵育6h解交聯。免疫共沉淀得到的產物應用PCR分析。在miR-148b編碼基因啟動子上的用于擴增包含結合PPARr位點片段的兩對引物分別為：5’-GCTCTAGAGTTACAATCATGTGCCAC-3’(上游引物)，5’-GCAAGCTTTCGAGACAAAGTTCTG-3’(下游引物)以及5’-GCAAGCTTTCTAGCAGCTGCCCAT-3’ (上游引物), 5’- GC CTCGAG TGGCTGTCTAGAAGACAGGATC -3’(下游引物)。用含有溴乙烷的2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物。

4生物信息學分析應用miRBase查詢pre-miR-148b序列及編碼基因，利用TRANSFAC和Promotor 2.0 Prediction Serve 軟件預測分析Pre-miR-148b的轉錄因子。

結　果

1吡格列酮劑量依賴性上調大鼠H9C2細胞中miR-148b表達水平見圖1。為明確PPARγ對miR-148b的調控作用,采用不同劑量的PPARγ激動劑吡格列酮(1～10μmol/L)刺激大鼠心肌H9C2細胞24 h后, 應用Real-time PCR方法檢測H9C2細胞中miR-148b表達水平。結果顯示與對照組相比，1 μmol/L吡格列酮對miR-148b表達無影響，5μmol/L吡格列酮顯著上調miR-148b表達約4倍(P<0.01)，10μmol/L吡格列酮顯著上調miR-148b表達約7倍。

2PPARγ上調大鼠H9C2細胞中miR-148b表達見圖2。為進一步證實吡格列酮是否特異性通過PPARγ上調H9C2中miR-148b表達，利用PPARγ特異性拮抗劑GW9662刺激大鼠心肌H9C2細胞后，與吡格列酮共孵育。采用吡格列酮刺激大鼠H9C2細胞，miR-148b表達量顯著上調(P<0.01)，在此基礎上加用PPARγ拮抗劑GW9662后，上調的miR-148b表達下降至對照水平(P<0.01)，提示PPARγ上調大鼠H9C2細胞中miR-148b表達水平。

圖1　吡格列酮劑量依賴性

圖2　PPARγ上調大鼠H9C2細胞中miR-148b表達

3生物信息學預測miR-148b啟動子與PPARγ結合位點見圖3。采用生物信息學方法預測miR-148b編碼基因啟動子上是否存在PPARγ結合位點。對miR-148b所在基因啟動子上游2000bp及下游500bp堿基進行分析，發現存在兩個PPARγ結合位點。

4PPARγ與miR-148b啟動子預測結合位點不發生結合見圖4。利用染色質免疫共沉淀實驗方法檢測PPARγ是否與miR-148b啟動子上的兩個預測結合位點結合。結果顯示：在大鼠心肌H9C2細胞中，PPARγ與miR-148b啟動子兩個預測位點結合均不能發生結合。

圖3　生物信息學預測miR-148b啟動子與PPARγ結合位點

圖4　PPARγ與miR-148b啟動子預測結合位點不發生結合

經典microRNA生成過程包括編碼microRNA的基因在RNA聚合酶II或RNA聚合酶III作用下轉錄出pri-miRNA；Drosha/DGCR8復合體剪切pri-miRNA生成pre-miRNA；pre-miRNA在exportin 5作用下從細胞核輸出到細胞漿中；Dicer酶剪切pre-miRNA生成成熟microRNA。除此途徑以外，研究顯示一些microRNA的生成不依賴于RNA聚合酶III(RNase III/Drosha或Dicer)的剪切過程[5]。本研究還發現：應用PPARγ激動劑能上調miR-148b表達量，由于吡格列酮不僅能激動PPARγ，還能激動其他信號分子，因此，我們在給予吡格列酮后，應用PPARγ特異性拮抗劑，發現上調的miR-148b水平下降至對照水平。證實PPARγ的確能上調miR-148b表達。

PPARγ是一種核轉錄因子，能通過轉錄途徑調節體內多種多樣代謝途徑[6]。為進一步研究PPARγ是否通過轉錄水平上調miR-148b表達。我們進一步預測發現miR-148b的編碼基因啟動子存在PPARγ結合位點。但通過進一步的染色質免疫共沉淀結果否定了PPARγ與miR-148b編碼基因啟動子的結合，這些結果提示：PPARγ并非從轉錄水平上調miR-148b表達水平。PPARγ上調miR-148b表達是通過何種方式實現，根據上述的miRNAs生成的調控機制研究推測：①PPARγ通過其他激活其他轉錄因子，其他轉錄因子于轉錄水平上調miR-148b表達；②PPARγ可能通過影響Drosha,Dicer或exportin5的表達及活化于轉錄后水平影響miR-148b表達；③近期，一種新的RNA結合蛋白被發現能參與轉錄與轉錄后耦聯過程[7]，關于PPARγ是否影響RNA結合蛋白進而通過轉錄-轉錄后耦聯過程影響miR-148b表達尚未明確，提示亦是一種可能的機制。對于PPARγ調控miR-148b表達從轉錄以外的何種方式實現仍有待于未來研究進一步深入探討。

[1]Zhao N, Yu H, Yu H,etal. MiRNA-711-SP1-collagen-I pathway is involved in the anti-fibrotic effect of pioglitazone in myocardial infarction[J]. Sci China Life Sci ，2013，56:431-439.

[2]Mohite AJ, Chillar AJ, Wijaya C,etal. Endogenous prostacyclin signaling regulating microRNA expression in mammalian cells[J]. FASEB J, 2009, 23: LB373.

[3]Yan W, Xuan C, Xuan L,etal. BN52021 protects rat cardiomyocyte from doxorubicin induced cardiotoxicity[J]. Int J Clin Exp Pathol， 2015，8:1719-1724.

[4]Porro A, Haber M, Diolaiti D,etal. Direct and coordinate regulation of ATP-binding cassette transporter genes by Myc factors generates specific transcription signatures that significantly affect the chemoresistance phenotype of cancer cells[J]. J Biol Chem ，2010，285：19532-19543.

[5]Havens MA, Reich AA, Duelli DM,etal. Biogenesis of mammalian microRNAs by a non-canonical processing pathway[J]. Nucleic Acids Res ,2012,40:4626-4640.

[6]Ahmadian M, Suh JM, Hah N,etal. PPARgamma signaling and metabolism: the good, the bad and the future[J]. Nat Med， 2013，19：557-566.

[7]Han N, Li W, Zhang M. The function of the RNA-binding protein hnRNP in cancer metastasis[J]. J Cancer Res Ther， 2013，9 (Suppl): 129-134.

(收稿：2016-03-20)

PPARγ up-regulated miR-148b expression in H9C2cells of rats is not dependent on the transcriptional level

First Department of Cardiovascular Medicine, The People，s Hospital of Shaanxi Province

(Xi’an 710068) Zhao NaZhang YongLiu Xiaojun et al

Objective: To explore wheather PPARγ up-regulates the miR-148b expression in cardiomyocytesof rats, and whether this process is dependent on the transcriptional level. Methods: Piogliatazone and GW9662 were used by PPARγ agonist and antagonist to stimulate H9C2cells in rats. Using Real-time PCR evaluate the expression level of miR-148b in H9C2cells of rats. Applying bioinformatics analysis predicte the binding sites between PPARγ and promoter region of miR-148b. Using chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay verify wheather PPARγ binds to the predicted binding sites in the promoter of miR-148b. Results: Pioglitazone up-regulated miR-148b expression in a dose-dependent manner (P<0.01).In addition, the up-regulated miR-148b expression by pioglitazone was inhibited totally by GW9662 (P<0.01). Bioinformatic analysis found two binding sites between PPARγ and promoter region of miR-148b. ChIP assay verify that PPARγ did not bind to the two predicted binding sites in the promoter region of miR-148b. Conclusion: PPARγ up-regulates miR-148b expression in cardiomyocytes of rats, but does no dependent on the transcriptional level.

Cell/physiopathologyMyocardiumTranscription factor/metabolismRibonucleotide/metabolismAnimails, laboratotyRats

R337.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.09.001

*國家自然科學基金青年科學基金項目(81400181)

△北京大學第三醫院