雙孢蘑菇培養料中纖維素降解菌的分離與純化*

郭仲杰，李洪榮，陳美元，蔡志欣，廖劍華

（福建省農業科學院食用菌研究所 特色食用菌繁育與栽培國家地方聯合工程研究中心，福建 福州 350014）

雙孢蘑菇培養料中纖維素降解菌的分離與純化*

郭仲杰，李洪榮，陳美元，蔡志欣，廖劍華

（福建省農業科學院食用菌研究所 特色食用菌繁育與栽培國家地方聯合工程研究中心，福建 福州 350014）

實驗從雙孢蘑菇一、二次發酵培養料樣品中，分離篩選出10株有降解纖維素能力的菌株。經過透明圈直徑、酶相對活性、濾紙酶活力和羧甲基纖維素酶活力的測定、比較，復篩出3株降解纖維素能力相對較強的菌株，分別是Ⅱ-4、Ⅱ-5、Ⅱ-6。

雙孢蘑菇；培養料；纖維素降解菌；酶活力

在我國農業生產中，每年產生了大量的農作物秸桿如小麥秸桿、稻草等，由于其主要成分木質素、纖維素和半纖維素的分子結構穩定，難以有效利用，除少量用作飼料，大部分都是被直接焚燒、廢棄，不僅造成巨大的資源浪費,而且還引起了嚴重的環境污染問題[1-3]。近年來，迅速發展的食用菌產業對秸桿的利用發揮了重大作用，用來栽培雙孢蘑菇[4]、巴西蘑菇[5]等多種食用菌，菌渣回田，變廢為寶，實現無害化循環利用。

雙孢蘑菇[Agaricus bisporus (J.E. Lange) Imbach]是一種草腐生食用菌[6]，其菌絲不能直接利用纖維素，秸桿必須經過堆制發酵才能被利用。培養料堆制發酵是在一定的環境條件下，由原料自身或空氣中所帶有的微生物的生長代謝而引發的一種高溫、好氧的生物降解過程；微生物繁殖活動是降解或轉化纖維素的關鍵。本研究將雙孢蘑菇培養料樣品進行分離，篩選出纖維素降解菌，并對其酶活力和對纖維素的降解能力的測定，復篩出高效纖維素降解菌，用于雙孢蘑菇培養料的促酵作用和發酵質量的檢測研究。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與預處理

采集不同發酵階段、不同位置的雙孢蘑菇培養料樣品。分別放入三角瓶中，加入適量無菌水和玻璃珠，振蕩30min,無菌紗布過濾，提取清液，以備待用。

1.2 培養基和試劑的配制

纖維素篩選培養基[7]：蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）10.0g，NaCl 5.0g，KH2PO4 1.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL。

鑒別培養基（纖維素剛果紅培養基）[8]：纖維粉1.88g，KH2PO4 0.50g，MgSO4·7H2O 0.5115g，剛果紅0.20g，瓊脂16.0g，明膠2.0g，雙孢蘑菇培養料浸出汁100mL，pH值7.0。

液體培養基[9]：蛋白胨3.0g，酵母膏0.50g，羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）5.0g，NaCl 5g，KH2PO4 4.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl·2H2O 0.3 g，pH值7.2～7.3 蒸餾水1000mL。

試劑：按照文獻[10]分別配制3,5-二硝基水楊酸試劑（DNS試劑）、檸檬酸緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液和1mg·mL-1葡萄糖標準溶液。

1.3 纖維素降解菌的分離、篩選及純化[11-12]

將樣品清液的10-3、10-4、10-5倍稀釋液均勻涂布于纖維素篩選平板培養基上，50℃培養箱倒置培養3～5d，隨時觀察。及時將平板上的菌落挑取，劃線分離得到的單菌落，接種于纖維素剛果紅培養基上，50℃培養箱倒置培養3～7d。挑選出在平板上生長快，透明水解圈大的單菌落，接種于CMC斜面培養基上，保藏，以備進一步研究。

1.4 纖維素降解菌酶活力測定

1.4.1 纖維素降解菌酶相對活性測定

將分離純化得到的單個菌株分別接種于纖維素剛果紅培養基上，50℃培養箱倒置培養5d，并測定記錄透明圈直徑(D)和菌落直徑(d)大小。

酶相對活性(A)=D/d

1.4.2 酶活力的測定[13]

1.4.2.1 粗酶液的制備

將分離到的菌株分別接種到裝有200ml液體培養基的三角瓶中，50℃，180r·min-1振蕩培養5 d，將培養液于4℃，4000r·min-1離心15 min，取上清液作為粗酶液。

1.4.2.2 標準曲線的繪制

采用3,5-二硝基水楊酸比色定糖法測定酶解液中還原糖的含量。分別取1mg·mL-1葡萄糖標準溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6mL，依次加入9支20mL的比色試管中，用蒸餾水稀釋到2.0mL，再加入DNS試劑1.5mL，在100℃水浴5min，冷卻，用蒸餾水定容至20mL搖勻，在波長520nm 處進行比色測定，用空白管溶液調零點，記錄吸光度值，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。

1.4.2.3 濾紙酶活力測定

取0.15mol·L-1HAc-NaAc緩沖液1.5mL，加入新華定量濾紙1條（1cm×6cm、50±1mg），再加入粗酶液0.5mL，搖勻，濾紙浸泡在液體中，50℃水浴保持1h，按DNS法測定糖。

以1mL酶液60min催化水解生成 1μmol葡萄糖的所需的酶量為1個酶活力單位，單位為U。

1.4.2.4 羧甲基纖維素酶 ( CMC) 酶活力測定

試管中加入1.5mL含0.5% CMC-Na的檸檬酸緩沖液，再移取入0.5mL粗酶液，搖勻，50℃水浴反應30min后，按DNS法測定糖。

以1mL酶液30min催化水解生成 1μmol葡萄糖的所需的酶量為1個酶活力單位，單位為U。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌的分離與純化、篩選

使用結構簡單，較易降解的羧甲基纖維素鈉作為單一碳源的選擇性培養基，進行初步篩選纖維素降解菌。用1mol·L-1的HCl染色，如果菌株有降解纖維素能力，則會水解雙糖，紅色水解圈沉淀變為深藍色，說明該菌株是纖維素降解菌。按此方法，分離得到36株具有降解纖維素能力的菌株，其中從一次發酵培養料篩選出11株，二次發酵培養料篩選出25株，結果表明二次發酵培養料內優勢生長的纖維素降解菌多于一次發酵培養料。

將分離純化得到的36株纖維素降解菌接種在纖維素剛果紅平板培養基上，50℃生化培養箱培養5d，觀測其透明圈的直徑并計算其相對酶活力，篩選出10株相對分解能力較強的菌株，分別命名為Ⅰ-1，Ⅰ-2，Ⅰ-3，Ⅱ-1，Ⅱ-1，Ⅱ-2，Ⅱ-3，Ⅱ-4，Ⅱ-5，Ⅱ-6，Ⅱ-7（Ⅰ代表一次發酵培養料，Ⅱ代表二次發酵培養料）。

2.2 纖維素降解菌酶活力測定

剛果紅纖維素平板透明圈篩選法簡便、快速、直接，如果作為唯一定量指標，其精確度不可靠，需要配合其他方法。纖維素酶活力是衡量菌株降解纖維素能力的一個定量指標，酶活力越高，菌株降解纖維素的能力就越強。分別對10株纖維素降解菌進行透明圈測定、酶相對活力、濾紙酶活力和CMC酶活力進行測定，結果如表1。

表1的測定結果表明，酶相對活力最大是Ⅱ-4，濾紙酶活力最大是Ⅱ-6， CMC酶活力最大是Ⅱ-5。各菌株的透明圈大小、酶相對活性、濾紙酶活力和CMC酶活力的測定結果一致性較好。另外CMC酶活力高的菌株，其濾紙酶活力，CMC 酶活力也高。

通過纖維素選擇培養基初篩，剛果紅纖維素平板透明圈篩選和液體發酵篩選的復篩，再進行培養、酶活測定的驗證，能夠快速、準確、有效地篩選出高纖維素降解能力的菌株。剛果紅纖維素平板透明圈篩選法可用于識別產纖維素降解酶的菌株外，還可用于初步判定酶活力的高低，大大地減輕了篩選工作量。

表1 菌株不同指標的測定結果

3 結論與討論

實驗發現在雙孢蘑菇培養料堆制發酵過程中，有大量的纖維素降解菌繁殖活動，分離出38株具有降解纖維素能力菌株，初篩出10株在酶活力較好的菌株，復篩出3株降解纖維素能力相對較強的菌株，分別是Ⅱ-4、Ⅱ-5、Ⅱ-6。

雙孢蘑菇培養料主原料是農作物秸桿，主要成分為纖維素和木質素。雙孢蘑菇菌絲不能直接利用纖維素和木質素，原料必須堆制發酵，經過纖維素降解菌和木質素降解菌的降解作用，制造出適合雙孢蘑菇菌絲生長的特異性基質。在這過程中，雙孢蘑菇培養料的物理結構的變化和化學成分的轉化與微生物的繁殖活動復雜地結合在一起。本試驗篩選出的菌株，可用于配制雙孢蘑菇的促酵劑，對增加纖維素降解菌的繁殖優勢，提高培養料質量，增加雙孢蘑菇生產效益有重大意義。試驗對研究雙孢蘑菇培養料內降解菌繁殖活動變化情況，探索培養料發酵質量的檢測新方法提供了基礎。

[1] 聶麥茜,劉加昌,朱玉璽,等.纖維素降解菌篩選分離與CMC酶提取及其活性研究[J].安徽農業科學，2008,36（19）:7956-7958,8002.

[2] 曲昭令,賈國清,李玉恒.平方米秸桿栽培雙孢蘑菇發酵工藝的初步研究[J].當代生態農業,2003，（1）:12-14.

[3] 陳潔,武高潮,王濤.利用玉米秸桿栽培雙孢蘑菇關鍵技術[J].西北園藝（蔬菜?？?2009（4）：22-23.

[4] 黃毅.食用菌栽培[M].北京:高等教育出版社,2008.

[5] 呂作舟.食用菌栽培學[M].北京:高等教育出版社,2006.

[6] 孔祥君,王澤生.中國蘑菇生產[M].北京:中國農業出版社,2000.

[7] 謝正曙.現代微生物培養基和試劑手冊[M].福州:福建科學技術出版社,1994.

[8] 葉姜喻.一種纖維素分解菌鑒別培養基[J].微生物學通報,1997,24(3):251-252.

[9] 曾青蘭.纖維素分解菌的分離篩選[J].安徽農業科學,2007,35(36):11946-11947.

[10] 李振紅,陸貽通.高效纖維素降解菌的篩選[J].環境污染與防治,2003,25(3):133-135.

[11] 李日強,辛小蕓.天然秸桿纖維素分解菌的分離選育[J].上海環境科學,2002,21(1):8-11.

[12] 周德慶.微生物學實習手冊[M].上海:上?？茖W技術出版社,1986.

[13] 沈萍,范秀容,李廣武.微生物學實驗[M].北京:高等教育出版社,1999:56-68.

10.3969/j.issn.1007-550X.2016.12.002

S646.9

A

1007-550X（2016）12-0042-04

福建省科技廳公益類項目（2014R1020-6），“十二五”國家科技支撐計劃“東南地區農牧廢棄物多級循環利用技術集成與示范”(2012BAD14B15-401)

2016-10-18

郭仲杰（1974-），男，高級工程師，主要從事食用菌遺傳育種及栽培的研究。

廖劍華，E-mail：1145698891@qq.com