金線魚魚皮抗凍蛋白理化性質(zhì)的研究

吳珊， 陳培琳，周雨嘉，傅維擎，曾紅亮，鄭寶東，張怡

（1．福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2．寧德師范學(xué)院，福建 寧德 352100）

金線魚魚皮抗凍蛋白理化性質(zhì)
的研究

吳珊1,2， 陳培琳1，周雨嘉1，傅維擎1，曾紅亮1，鄭寶東1，張怡1

（1．福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2．寧德師范學(xué)院，福建 寧德 352100）

為了研究金線魚魚皮抗凍蛋白的理化性質(zhì)，文章以金線魚魚皮抗凍蛋白為原料，對其等電點、親水性、表面疏水性、熱穩(wěn)定性、起泡性以及乳化性等理化性質(zhì)進行研究。結(jié)果表明，金線魚魚皮抗凍蛋白的等電點為pH4；其水分完全揮發(fā)溫度為174℃，顯著高于PBS（磷酸緩沖液）及BSA（牛血清蛋白），表明該抗凍蛋白增大了體系中水分蒸發(fā)的難度；加熱至81.40℃時，魚皮抗凍蛋白失去熱滯活性，表明魚皮抗凍蛋白屬于非熱穩(wěn)定抗凍蛋白。

金線魚；魚皮；抗凍蛋白；理化性質(zhì)

金線魚是鱸形目(Perciformes)金線魚科(Nemipteridae)金線魚屬(Nemipterus)的其中一個物種[1]，主要分布于西太平洋區(qū)，包括日本、韓國、中國、菲律賓、印尼、越南、泰國、澳洲等海域，中國產(chǎn)于南海、東海和黃海南部，以南海產(chǎn)量較多[2]，是主要的海產(chǎn)魚類。金線魚肉質(zhì)細嫩，常常將其加工為魚糜制品[3]。在魚糜制品加工過程中，通常利用金線魚魚肉作為食品原料，因此造成大量金線魚的魚頭、魚皮、魚鱗、魚骨等原材料的浪費，為了提高金線魚的利用價值，將魚皮進一步開發(fā)成為魚皮抗凍蛋白具有廣闊的前景。抗凍蛋白（AFPs）是一類具有提高生物抗凍能力的蛋白質(zhì)類化合物的總稱[4]。抗凍蛋白能與冰晶相互作用，抑制冰的重結(jié)晶化和修飾冰晶[5]。蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物與蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)存在較大差異，如等電點、親水性、表面疏水性、熱穩(wěn)定性、起泡性、乳化性以及氨基酸組成等[6]，這些性質(zhì)的差異導(dǎo)致其加工特性及生理功能的不一致。

因此，文章以金線魚魚皮抗凍蛋白為原料，對其等電點、親水性、表面疏水性、熱穩(wěn)定性、起泡性以及乳化性等理化性質(zhì)進行研究，以便了解和掌握金線魚魚皮抗凍蛋白的加工適用性，以及為抗凍蛋白的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)。

1材料與儀器

1.1 試驗材料

金線魚魚皮抗凍蛋白：實驗室自制，冷凍干燥備用。

1.2 試驗儀器

TGA/SDTA851e 熱分析系統(tǒng)：瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；

DSC 200 F3差示掃描量熱儀：德國耐馳儀器制造有限公司；

MK2000型INSTEC冷熱臺：北京美嘉圖科技有限公司；

Ci-L型尼康顯微鏡：福州達士通儀器設(shè)備有限公司；

H1850R冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；

LG-1.0型真空冷凍干燥機：新陽速凍設(shè)備制造有限公司；

UV-7200紫外可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；

Kjeltec TM 2300 半自動凱氏定氮儀，丹麥瑞典FOSS 公司。

2 試驗方法

2.1 等電點測定

稱取魚皮抗凍蛋白樣品與蒸餾水1:100（W/V）混合，用0.5mol/L NaOH調(diào)至pH8.0，室溫攪拌1h后，6000r/min離心20min，取等量上清液，用0.5mol/L HCl調(diào)至不同pH值（pH3.0～7.0）沉淀蛋白質(zhì)并離心，雙縮脲法分別測定沉淀前后上清液中蛋白質(zhì)含量，上清液中蛋白質(zhì)殘留率最低時的pH值即為蛋白質(zhì)的等電點[7]。

2.2 親水性測定

用熱重/差熱分析儀法分析魚皮抗凍蛋白的親水性[8]。具體步驟為：將樣品溶于PBS中，配制20 mg/mL的抗凍蛋白溶液。移取20μL溶液于陶瓷坩堝中，待樣品池穩(wěn)定后，開始升溫，升溫區(qū)間為30℃～800℃，升溫速率為5℃/min，保護氮氣流速為10mL/min，記錄升溫過程中樣品重量的變化并分別繪制TGA-SDTA曲線。分別以PBS、BSA為對照。

2.3 表面疏水性測定

將魚皮抗凍蛋白溶解于PBS（10 mmol/L，pH 8.0）中使終濃度為1mg/mL，取2mL加入40μL 8-苯胺萘磺-1-酸鹽（ANS）溶液進行熒光掃描，激發(fā)波長為375nm，發(fā)射波長為410nm～560nm。

2.4 熱穩(wěn)定性測定

采用DSC法魚皮抗凍蛋白溶液的熱穩(wěn)定性進行分析。具體方法為：將濃度為20mg/mL的抗凍蛋白溶液密封在鋁盤中，以空盤做參比，20℃恒溫5min，然后以1℃/mL升溫速率由30℃程序升溫至90℃，恒溫5min，記錄升溫過程中的熱流變化，對熱流曲線進行積分，獲得的峰值溫度即為抗凍蛋白的熱變性溫度。

2.5 起泡性和泡沫穩(wěn)定性測定

將0.2g抗凍蛋白溶解到10mL緩沖液中，調(diào)節(jié)pH值，然后在高速組織搗碎機中均質(zhì)（1 00 00 r/min～12000 r/min）2 min，制成乳濁液[9]。均質(zhì)停止1min后，記錄泡沫體積V1（mL），計算起泡性。均質(zhì)停止20 min后，記錄泡沫體積V2（mL），計算泡沫穩(wěn)定性如下：

2.6 乳化性和乳化穩(wěn)定性測定

取60mL0.1%調(diào)至不同pH值的待測樣品，加入30ml芝麻油，在10000r/min，25℃下乳化不同的時間。然后以0.1%SDS溶液（十二烷基硫酸鈉，pH7.0）稀釋 100倍，測定500nm處的吸光度，以SDS溶液作為空白[10]。以乳化活性指數(shù)（Emulsifying Activity Index，EAI）表示，計算公式為：

式中：A500—500nm處吸光值；

C—溶液中樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量mg；

Φ—油相體積系數(shù)，取值0.25；

N—稀釋倍數(shù)。

乳化穩(wěn)定性（Emulsifying Stability Index，ESI）用乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESl）表示，計算公式為：

式中：A0為零時刻的吸光值；△T為時間差（min）；△A為△T內(nèi)的吸光值差。本試驗中，每隔10分鐘測定一次，故△T為定值。令K= A0/△A，則K與ESI成正比。為了避免計算時出現(xiàn)△A為0及負值，故引進吸光值比（K）來描述乳化穩(wěn)定性。

3 實驗結(jié)果

3.1 金線魚魚皮抗凍蛋白等電點分析

由圖1可以看出，金線魚魚皮抗凍蛋白在pH4時易凝集成大顆粒，沉淀析出，故上清液中蛋白殘留率最低，其上清液中蛋白殘留率為53.0%，而在pH4兩側(cè)蛋白殘留率均較高。因此，魚皮抗凍蛋白的等電點范圍為pH4.0左右。

3.2 金線魚魚皮抗凍蛋白親水性分析

圖2為樣品加熱過程中的TGA-SDTA曲線。樣品溶解用的溶劑PBS、BSA用作對照。樣品加熱過程中溶質(zhì)對水分的束縛能力能夠一定程度上反映溶質(zhì)的親水能力。TGA能夠反映物質(zhì)在加熱過程中重量的變化，其中樣品重量損失90%時的溫度可以定義為水分揮發(fā)完全的溫度。PBS、BSA和AFP水分完全揮發(fā)的溫度分別為137℃、164℃和174℃，即魚皮抗凍蛋白的水分完全揮發(fā)溫度顯著高于PBS及BSA，表明該抗凍蛋白的加入增大了體系中水分蒸發(fā)的難度，即魚皮抗凍蛋白具有較強的親水性。SDTA曲線反應(yīng)加熱過程中由于樣品吸熱引起的樣品與樣品池溫度的差異。200℃前，SDTA曲線變化劇烈，因為需要大量吸熱用于水分揮發(fā)，樣品與樣品池之間具有較大的溫度差；200℃左右，SDTA曲線趨于平緩，由于體系中水分完全揮發(fā)，不需要從外界吸收熱量，樣品與樣品池溫度達到一致；200℃后，SDTA曲線再次出現(xiàn)緩慢下降的趨勢，因為樣品中溶質(zhì)加熱分解需要從外界吸收熱量，樣品中溶質(zhì)含量較低，吸熱引起的樣品與樣品池間溫度差異不顯著。

3.3 金線魚魚皮抗凍蛋白表面疏水性分析

魚皮抗凍蛋白表面疏水性熒光光譜圖見圖3。從圖中可以看出魚皮抗凍蛋白表面疏水性弱于BSA，可以認為魚皮抗凍蛋白具有較強的親水性，與TGASDTA曲線中關(guān)于魚皮抗凍蛋白親水性測定結(jié)果一致。

3.4 金線魚魚皮抗凍蛋白熱穩(wěn)定性分析

根據(jù)熱處理過程中的穩(wěn)定性，AFP可以分為熱穩(wěn)定AFP和非熱穩(wěn)定AFP。目前已獲得的AFP中大部分為非熱穩(wěn)定AFP。AFP的熱穩(wěn)定現(xiàn)象是90年代開始研究的比較多的一種現(xiàn)象。這是因為，一方面由于熱處理在食品加工中的廣泛使用，明確AFP的熱穩(wěn)定性對其在食品工業(yè)中的應(yīng)用很有必要；另一方面，在熱穩(wěn)定AFP純化過程中可以通過加熱處理使雜蛋白發(fā)生選擇性變性沉淀并通過離心去除，從而大大簡化純化步驟，降低純化成本。從圖4中可以看出，魚皮抗凍蛋白溶液的升溫過程中形成放熱曲線，同時對加熱處理后的魚皮抗凍蛋白的活性進行測定，結(jié)果表明熱處理后，魚皮抗凍蛋白失去熱帶活性，表明魚皮抗凍蛋白屬于非熱穩(wěn)定AFP，其熱變性溫度約81.40℃，因此，魚皮抗凍蛋白不能耐受高溫處理[11]。

3.5 金線魚魚皮抗凍蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性分析

由圖5可知，pH值對起泡性的影響在酸性和堿性區(qū)域都有增加，而堿性區(qū)域起泡性的提高遠超過酸性區(qū)域。說明起泡性與蛋白質(zhì)的溶解性存在著一定的關(guān)系，溶解的蛋白有利于泡沫的形成。蛋白的表面疏水性由于凈電荷的增加而減少，這樣蛋白質(zhì)的溶解性增加，有利于其在氣-水界面迅速展開，卷入更多的空氣形成泡沫。在抗凍蛋白等電點附近，其起泡性最低，泡沫穩(wěn)定性最大。由圖6可知，金線魚魚皮抗凍蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性隨濃度的增加呈上升的趨勢[12]。多肽濃度較大時，蛋白質(zhì)間的相互作用有利于形成較厚的吸附膜，使泡沫穩(wěn)定性增加。

3.6 金線魚魚皮抗凍蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性分析

pH值對魚皮抗凍蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響如圖7所示，在pH值為2～4范圍內(nèi)，魚皮抗凍蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性隨著pH值的增加而降低；當(dāng)pH值大于4之后，魚皮抗凍蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性隨著pH值的增加而升高。pH值對魚皮抗凍蛋白乳化性的影響和pH值對乳化穩(wěn)定性的影響規(guī)律具有一致性，在抗凍蛋白等電點附近，其乳化性和乳化穩(wěn)定性最低。濃度對魚皮抗凍蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響如圖8所示，在2～12mg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著抗凍蛋白濃度的增加，其乳化性降低，乳化穩(wěn)定性升高。低蛋白濃度時，肽的快速吸收，形成較好的擴散作用，有效促進多肽與油的相互作用；高蛋白濃度時，活化能屏障不允許蛋白以擴散的方式移動，導(dǎo)致多肽的聚集，進而降低乳化性能。

4 結(jié)論

金線魚魚皮抗凍蛋白的等電點為pH4；其水分完全揮發(fā)溫度為174℃，顯著高于PBS及BSA，表明該抗凍蛋白增大了體系中水分蒸發(fā)的難度，即魚皮抗凍蛋白具有較強的親水性；魚皮抗凍蛋白的表面疏水性弱于BSA，可認為其具較強的親水性；加熱至81.40℃時，魚皮抗凍蛋白開始失去熱滯活性，表明魚皮抗凍蛋白屬于非熱穩(wěn)定抗凍蛋白；在等電點附近，其乳化性、乳化穩(wěn)定性和起泡性最小，而起泡穩(wěn)定性在這點最大；隨著濃度的增大，抗凍蛋白的起泡性、起泡穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性逐漸增大，乳化性降低。

[1] 儀淑敏, 馬興勝, 勵建榮, 等. 超高壓誘導(dǎo)魚糜凝膠形成中水分特性及凝膠強度的相關(guān)性研究 [J]. 中國食品學(xué)報,2015, 15(07): 26-31.

[2] 寧平. 中國金線魚科魚類分類、系統(tǒng)發(fā)育及動物地理學(xué)研究[D]. 中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所）, 2012.

[3] 王金路, 王雪琦, 儀淑敏, 等. 金線魚魚丸冷藏過程中品質(zhì)變化規(guī)律研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2015, 34(01): 14-19.

[4] 陳闖, 姚駿, 王麒琳, 等. 抗凍蛋白的研究現(xiàn)狀及其應(yīng)用[J]. 食品研究與開發(fā), 2016, 12:199-201.

[5] Devries A L.Antifreeze glycopeptides and peptides: interactions with ice and water [J]. Methods in Enzymology, 1986,127(127):293-303.

[6] 劉立品. 青稞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能特性的研究[D]. 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2015.

[7] 張立娟, 孔保華, 劉騫. 環(huán)境條件對豬血漿蛋白功能性質(zhì)的影響[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(11): 37-42.

[8] 鞏子路. 新疆冷水魚中抗凍蛋白的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定[D]. 石河子大學(xué), 2015.

[9] 侯夏樂. 蕓豆生育特性及蛋白組分功能特性研究[D]. 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2015.

[10] 李艷青, 孔保華, 夏秀芳, 等. 羥自由基氧化對鯉魚肌原纖維蛋白乳化性及凝膠性的影響 [J]. 食品科學(xué), 2012, (09):31-35.

[11] 丁丹華, 彭光華, 何東平. HPLC法測定油茶籽多肽相對分子質(zhì)量分布及氨基酸組成[J]. 中國油脂, 2010, 35(11):68-71.

[12] 任俊鳳, 任婷婷, 朱蓓薇. 河豚魚皮膠原蛋白肽的提取及其抗氧化活性的研究[J]. 中國食品學(xué)報, 2009, 9(01): 77-83.

10.3969/j.issn.1007-550X.2016.12.003

TS201.4

A

1007-550X（2016）12-0046-05

2016-10-16

吳珊（1990-），女，碩士，研究方向：食品加工技術(shù)。

張怡（1975-），女，教授，博士，Email:zyifst@163.com