金線魚魚皮抗凍蛋白理化性質的研究

吳珊， 陳培琳，周雨嘉，傅維擎，曾紅亮，鄭寶東，張怡

（1．福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2．寧德師范學院，福建 寧德 352100）

金線魚魚皮抗凍蛋白理化性質
的研究

吳珊1,2， 陳培琳1，周雨嘉1，傅維擎1，曾紅亮1，鄭寶東1，張怡1

（1．福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2．寧德師范學院，福建 寧德 352100）

為了研究金線魚魚皮抗凍蛋白的理化性質，文章以金線魚魚皮抗凍蛋白為原料，對其等電點、親水性、表面疏水性、熱穩定性、起泡性以及乳化性等理化性質進行研究。結果表明，金線魚魚皮抗凍蛋白的等電點為pH4；其水分完全揮發溫度為174℃，顯著高于PBS（磷酸緩沖液）及BSA（牛血清蛋白），表明該抗凍蛋白增大了體系中水分蒸發的難度；加熱至81.40℃時，魚皮抗凍蛋白失去熱滯活性，表明魚皮抗凍蛋白屬于非熱穩定抗凍蛋白。

金線魚；魚皮；抗凍蛋白；理化性質

金線魚是鱸形目(Perciformes)金線魚科(Nemipteridae)金線魚屬(Nemipterus)的其中一個物種[1]，主要分布于西太平洋區，包括日本、韓國、中國、菲律賓、印尼、越南、泰國、澳洲等海域，中國產于南海、東海和黃海南部，以南海產量較多[2]，是主要的海產魚類。金線魚肉質細嫩，常常將其加工為魚糜制品[3]。在魚糜制品加工過程中，通常利用金線魚魚肉作為食品原料，因此造成大量金線魚的魚頭、魚皮、魚鱗、魚骨等原材料的浪費，為了提高金線魚的利用價值，將魚皮進一步開發成為魚皮抗凍蛋白具有廣闊的前景。抗凍蛋白（AFPs）是一類具有提高生物抗凍能力的蛋白質類化合物的總稱[4]。抗凍蛋白能與冰晶相互作用，抑制冰的重結晶化和修飾冰晶[5]。蛋白質酶解產物與蛋白質的理化性質存在較大差異，如等電點、親水性、表面疏水性、熱穩定性、起泡性、乳化性以及氨基酸組成等[6]，這些性質的差異導致其加工特性及生理功能的不一致。

因此，文章以金線魚魚皮抗凍蛋白為原料，對其等電點、親水性、表面疏水性、熱穩定性、起泡性以及乳化性等理化性質進行研究，以便了解和掌握金線魚魚皮抗凍蛋白的加工適用性，以及為抗凍蛋白的產業化應用打下良好的基礎。

1材料與儀器

1.1 試驗材料

金線魚魚皮抗凍蛋白：實驗室自制，冷凍干燥備用。

1.2 試驗儀器

TGA/SDTA851e 熱分析系統：瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；

DSC 200 F3差示掃描量熱儀：德國耐馳儀器制造有限公司；

MK2000型INSTEC冷熱臺：北京美嘉圖科技有限公司；

Ci-L型尼康顯微鏡：福州達士通儀器設備有限公司；

H1850R冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；

LG-1.0型真空冷凍干燥機：新陽速凍設備制造有限公司；

UV-7200紫外可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；

Kjeltec TM 2300 半自動凱氏定氮儀，丹麥瑞典FOSS 公司。

2 試驗方法

2.1 等電點測定

稱取魚皮抗凍蛋白樣品與蒸餾水1:100（W/V）混合，用0.5mol/L NaOH調至pH8.0，室溫攪拌1h后，6000r/min離心20min，取等量上清液，用0.5mol/L HCl調至不同pH值（pH3.0～7.0）沉淀蛋白質并離心，雙縮脲法分別測定沉淀前后上清液中蛋白質含量，上清液中蛋白質殘留率最低時的pH值即為蛋白質的等電點[7]。

2.2 親水性測定

用熱重/差熱分析儀法分析魚皮抗凍蛋白的親水性[8]。具體步驟為：將樣品溶于PBS中，配制20 mg/mL的抗凍蛋白溶液。移取20μL溶液于陶瓷坩堝中，待樣品池穩定后，開始升溫，升溫區間為30℃～800℃，升溫速率為5℃/min，保護氮氣流速為10mL/min，記錄升溫過程中樣品重量的變化并分別繪制TGA-SDTA曲線。分別以PBS、BSA為對照。

2.3 表面疏水性測定

將魚皮抗凍蛋白溶解于PBS（10 mmol/L，pH 8.0）中使終濃度為1mg/mL，取2mL加入40μL 8-苯胺萘磺-1-酸鹽（ANS）溶液進行熒光掃描，激發波長為375nm，發射波長為410nm～560nm。

2.4 熱穩定性測定

采用DSC法魚皮抗凍蛋白溶液的熱穩定性進行分析。具體方法為：將濃度為20mg/mL的抗凍蛋白溶液密封在鋁盤中，以空盤做參比，20℃恒溫5min，然后以1℃/mL升溫速率由30℃程序升溫至90℃，恒溫5min，記錄升溫過程中的熱流變化，對熱流曲線進行積分，獲得的峰值溫度即為抗凍蛋白的熱變性溫度。

2.5 起泡性和泡沫穩定性測定

將0.2g抗凍蛋白溶解到10mL緩沖液中，調節pH值，然后在高速組織搗碎機中均質（1 00 00 r/min～12000 r/min）2 min，制成乳濁液[9]。均質停止1min后，記錄泡沫體積V1（mL），計算起泡性。均質停止20 min后，記錄泡沫體積V2（mL），計算泡沫穩定性如下：

2.6 乳化性和乳化穩定性測定

取60mL0.1%調至不同pH值的待測樣品，加入30ml芝麻油，在10000r/min，25℃下乳化不同的時間。然后以0.1%SDS溶液（十二烷基硫酸鈉，pH7.0）稀釋 100倍，測定500nm處的吸光度，以SDS溶液作為空白[10]。以乳化活性指數（Emulsifying Activity Index，EAI）表示，計算公式為：

式中：A500—500nm處吸光值；

C—溶液中樣品蛋白質質量mg；

Φ—油相體積系數，取值0.25；

N—稀釋倍數。

乳化穩定性（Emulsifying Stability Index，ESI）用乳化穩定性指數（ESl）表示，計算公式為：

式中：A0為零時刻的吸光值；△T為時間差（min）；△A為△T內的吸光值差。本試驗中，每隔10分鐘測定一次，故△T為定值。令K= A0/△A，則K與ESI成正比。為了避免計算時出現△A為0及負值，故引進吸光值比（K）來描述乳化穩定性。

3 實驗結果

3.1 金線魚魚皮抗凍蛋白等電點分析

由圖1可以看出，金線魚魚皮抗凍蛋白在pH4時易凝集成大顆粒，沉淀析出，故上清液中蛋白殘留率最低，其上清液中蛋白殘留率為53.0%，而在pH4兩側蛋白殘留率均較高。因此，魚皮抗凍蛋白的等電點范圍為pH4.0左右。

3.2 金線魚魚皮抗凍蛋白親水性分析

圖2為樣品加熱過程中的TGA-SDTA曲線。樣品溶解用的溶劑PBS、BSA用作對照。樣品加熱過程中溶質對水分的束縛能力能夠一定程度上反映溶質的親水能力。TGA能夠反映物質在加熱過程中重量的變化，其中樣品重量損失90%時的溫度可以定義為水分揮發完全的溫度。PBS、BSA和AFP水分完全揮發的溫度分別為137℃、164℃和174℃，即魚皮抗凍蛋白的水分完全揮發溫度顯著高于PBS及BSA，表明該抗凍蛋白的加入增大了體系中水分蒸發的難度，即魚皮抗凍蛋白具有較強的親水性。SDTA曲線反應加熱過程中由于樣品吸熱引起的樣品與樣品池溫度的差異。200℃前，SDTA曲線變化劇烈，因為需要大量吸熱用于水分揮發，樣品與樣品池之間具有較大的溫度差；200℃左右，SDTA曲線趨于平緩，由于體系中水分完全揮發，不需要從外界吸收熱量，樣品與樣品池溫度達到一致；200℃后，SDTA曲線再次出現緩慢下降的趨勢，因為樣品中溶質加熱分解需要從外界吸收熱量，樣品中溶質含量較低，吸熱引起的樣品與樣品池間溫度差異不顯著。

3.3 金線魚魚皮抗凍蛋白表面疏水性分析

魚皮抗凍蛋白表面疏水性熒光光譜圖見圖3。從圖中可以看出魚皮抗凍蛋白表面疏水性弱于BSA，可以認為魚皮抗凍蛋白具有較強的親水性，與TGASDTA曲線中關于魚皮抗凍蛋白親水性測定結果一致。

3.4 金線魚魚皮抗凍蛋白熱穩定性分析

根據熱處理過程中的穩定性，AFP可以分為熱穩定AFP和非熱穩定AFP。目前已獲得的AFP中大部分為非熱穩定AFP。AFP的熱穩定現象是90年代開始研究的比較多的一種現象。這是因為，一方面由于熱處理在食品加工中的廣泛使用，明確AFP的熱穩定性對其在食品工業中的應用很有必要；另一方面，在熱穩定AFP純化過程中可以通過加熱處理使雜蛋白發生選擇性變性沉淀并通過離心去除，從而大大簡化純化步驟，降低純化成本。從圖4中可以看出，魚皮抗凍蛋白溶液的升溫過程中形成放熱曲線，同時對加熱處理后的魚皮抗凍蛋白的活性進行測定，結果表明熱處理后，魚皮抗凍蛋白失去熱帶活性，表明魚皮抗凍蛋白屬于非熱穩定AFP，其熱變性溫度約81.40℃，因此，魚皮抗凍蛋白不能耐受高溫處理[11]。

3.5 金線魚魚皮抗凍蛋白起泡性和泡沫穩定性分析

由圖5可知，pH值對起泡性的影響在酸性和堿性區域都有增加，而堿性區域起泡性的提高遠超過酸性區域。說明起泡性與蛋白質的溶解性存在著一定的關系，溶解的蛋白有利于泡沫的形成。蛋白的表面疏水性由于凈電荷的增加而減少，這樣蛋白質的溶解性增加，有利于其在氣-水界面迅速展開，卷入更多的空氣形成泡沫。在抗凍蛋白等電點附近，其起泡性最低，泡沫穩定性最大。由圖6可知，金線魚魚皮抗凍蛋白的起泡性和泡沫穩定性隨濃度的增加呈上升的趨勢[12]。多肽濃度較大時，蛋白質間的相互作用有利于形成較厚的吸附膜，使泡沫穩定性增加。

3.6 金線魚魚皮抗凍蛋白乳化性和乳化穩定性分析

pH值對魚皮抗凍蛋白乳化性和乳化穩定性的影響如圖7所示，在pH值為2～4范圍內，魚皮抗凍蛋白乳化性和乳化穩定性隨著pH值的增加而降低；當pH值大于4之后，魚皮抗凍蛋白乳化性和乳化穩定性隨著pH值的增加而升高。pH值對魚皮抗凍蛋白乳化性的影響和pH值對乳化穩定性的影響規律具有一致性，在抗凍蛋白等電點附近，其乳化性和乳化穩定性最低。濃度對魚皮抗凍蛋白乳化性和乳化穩定性的影響如圖8所示，在2～12mg/mL濃度范圍內，隨著抗凍蛋白濃度的增加，其乳化性降低，乳化穩定性升高。低蛋白濃度時，肽的快速吸收，形成較好的擴散作用，有效促進多肽與油的相互作用；高蛋白濃度時，活化能屏障不允許蛋白以擴散的方式移動，導致多肽的聚集，進而降低乳化性能。

4 結論

金線魚魚皮抗凍蛋白的等電點為pH4；其水分完全揮發溫度為174℃，顯著高于PBS及BSA，表明該抗凍蛋白增大了體系中水分蒸發的難度，即魚皮抗凍蛋白具有較強的親水性；魚皮抗凍蛋白的表面疏水性弱于BSA，可認為其具較強的親水性；加熱至81.40℃時，魚皮抗凍蛋白開始失去熱滯活性，表明魚皮抗凍蛋白屬于非熱穩定抗凍蛋白；在等電點附近，其乳化性、乳化穩定性和起泡性最小，而起泡穩定性在這點最大；隨著濃度的增大，抗凍蛋白的起泡性、起泡穩定性和乳化穩定性逐漸增大，乳化性降低。

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10.3969/j.issn.1007-550X.2016.12.003

TS201.4

A

1007-550X（2016）12-0046-05

2016-10-16

吳珊（1990-），女，碩士，研究方向：食品加工技術。

張怡（1975-），女，教授，博士，Email:zyifst@163.com