清肝祛濕活血方對非酒精性脂肪肝大鼠Srebp-1c表達的影響*

張玉香，王一強，姜德民，史曉偉，王俊喹甘肅省中醫學校，甘肅 蘭州 70050；2甘肅省中醫院；西和縣中醫醫院

清肝祛濕活血方對非酒精性脂肪肝大鼠Srebp-1c表達的影響*

張玉香1，王一強1，姜德民1，史曉偉2△，王俊喹3
1甘肅省中醫學校，甘肅 蘭州 730050；2甘肅省中醫院；3西和縣中醫醫院

目的：探討清肝祛濕活血方對非酒精性脂肪肝大鼠肝臟固醇調節元件結合蛋白-1c（Srebp-1c）表達的影響。方法：將雄性SD大鼠隨機分為空白組，模型組，多烯磷脂酰膽堿組，清肝祛濕活血方低、中、高劑量組6組。常規飼養7天后，空白組給予普通飼料喂養；其余各組給予高脂飼料喂養+腹腔注射四環素制備非酒精性脂肪肝大鼠模型，共4周。造模成功后清肝祛濕活血方各劑量組用清肝祛濕活血方治療，多烯磷脂酰膽堿組予易善復治療，模型組和空白組給予等量蒸餾水。給藥4周后觀察大鼠血脂、肝組織病理學改變及Western Blot法測定肝臟Srebp-1c表達。結果：與模型組比較，清肝祛濕活血方低、中、高劑量組TG和TC明顯降低（P＜0.05）；肝脂肪變性明顯減輕；肝臟Srebp-1c表達均明顯下降（P＜0.01）。結論：清肝祛濕活血方能下調大鼠肝臟Srebp-1c表達，對非酒精性脂肪肝有較好的治療作用。

非酒精性脂肪肝；清肝；祛濕；活血；Srebp-1c

非酒精性脂肪肝(non alcohol ic fatty l iver disease，NAFLD)是以肝實質細胞脂肪變性和脂肪堆積為主要病理特征，但無過量飲酒史的一種肝病綜合征［1］。目前已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病［2］，被公認為隱蔽性肝硬化的常見原因。研究表明［3-4］固醇調節元件結合蛋白-1c (Srebp-1c)主要參與調節肝臟中脂肪酸和甘油三酯的合成，并參與非酒精性脂肪肝的發生發展［5］。但是目前尚缺少減少脂肪堆積的藥物，前期臨床觀察發現當地名醫王俊喹自擬清肝祛濕活血方對ANFLD有較好的治療作用，但作用機制不明確。本研究采用清肝祛濕活血方干預高脂飲食誘發NAFLD大鼠模型，觀察大鼠肝臟組織SREBP-1c表達、血脂及病理改變，探討清肝祛濕活血方對NAFLD保護機制。

1　材料與方法

1.1動物選取同批雄性SD大鼠90只，清潔級，體質量(150±20)g，購自甘肅中醫藥大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXKG桂2009-0002。實驗前將動物置于室內適應環境1周，室溫18～20℃，標準大鼠飼料喂養，自由進食，飲用自來水。1.2藥物清肝祛濕活血方中藥煎劑(夏枯草10 g，密蒙花10g，青葙子10 g，茵陳10 g，垂盆草10 g，丹參15 g，郁金10 g)由甘肅中醫藥大學藥學實驗室制備。多烯磷脂酰膽堿(易善復，北京安萬特制藥有限公司生產，國藥準字J20050028，規格228mg/粒)。

1.3試劑大鼠固醇調節元件結合蛋白1C (Srebp-1c，批號：201508）、總膽固醇(TC，批號：201509)、甘油三酯(TG，批號：201509)檢測試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.4儀器TOSHIBATBA－120FR全自動生化分析儀(日本東芝公司)；OHAUS1/1000型電子天平(美國BECKANCOULTER公司)；IX71-22FL/PH倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；HH-S型數顯恒溫水浴箱(江蘇省金壇市醫療儀器廠)；LKB-Ⅲ型超薄切片機切片(瑞典LKB公司)；5417R低溫高速離心機(德國EPPENDORF公司)；TC-120智能程控生物組織自動脫水機 (湖北省孝感市泰維電子設備有限公司生產)。

1.5方法

1.5.1實驗分組與造模將90只SD大鼠按照隨機數字表法分為6組：空白組，模型組，多烯磷脂酰膽堿組，清肝祛濕活血方低、中、高劑量組，(以下分別簡稱：空白組，模型組，易善復組，低劑量組，中劑量組，高劑量組)，每組15只。常規飼養7天后，空白組給予普通飼料喂養60天；其余各組按照聶文山等［5］的造模方法，予高脂飼料(84%基礎飼料+10%豬油+5%蛋黃粉+1%膽固醇)，并于制模后腹腔注射四環素150mg/kg，以后每6天腹腔注射1次四環素100mg/kg，共計6次，并于實驗前(0d）和制模后第6、12、18、24、30天測量大鼠體質量，并根據體質量調整給藥量，第30天造模成功(已經通過預實驗，病理切片顯示此造模方法成功)。

1.5.2給藥方法造模結束后，即第31天開始，參照《藥理實驗方法學》中［6］人與大鼠劑量的換算方法計算出大鼠用藥量是成人劑量的9倍。算出大鼠的對應給藥量。即清肝祛濕活血方低劑量組給予5.63g生藥/kg、中劑量組給予11.25 g生藥/kg、高劑量組給予22.5 g生藥/kg，易善復組參照文獻［7］給予550mg/(kg·d)。使用時，按照大鼠灌藥容積20mL/kg計算，用蒸餾水將清肝祛濕活血方煎劑配成小劑量組0.28 g/mL、中劑量組0.56 g/mL、大劑量組1.13 g/mL，造模成功后大鼠平均體質量按200 g/只計算，各組大鼠每次每只灌胃4mL，1次/d。空白組與模型組給予蒸餾水代替，灌胃量4mL/d，1次/d。各組連續給藥30天。實驗過程中觀察比較各組大鼠的一般情況。

1.6指標采集與檢測

1.6.1大鼠固醇調節元件結合蛋白1c（Srebp-1c）檢測取100mg肝臟組織，提取肝臟組織總蛋白，每個樣品取等量蛋白50μg，將12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后分離的蛋白質轉移到PVDF膜。5%BSA室溫下封閉2小時，加入小鼠抗大鼠SPEBP-1c(稀釋比例1∶500）、小鼠抗大鼠β-actin(稀釋比例∶1000)一抗，4℃孵育過夜。洗膜后辣根過氧化物酶標記的二抗羊抗兔IgG或羊抗小鼠IgG(稀釋比例1∶5000)，室溫孵育2小時。TBST洗膜后加ECT試劑，顯影成像。用美國UVP公司Lab Works 4.5軟件對Western blot條帶進行定量分析。

1.6.2血清生化指標的檢測沿大鼠腹中線迅速剪開腹腔，用10mL注射器無菌采取腹主動脈血8mL，常規分離血清，-20℃凍存備測，用于測定TC、TG。

1.6.3肝臟組織學觀察各組大鼠15只，留取肝左葉同一部位新鮮肝組織，清洗后置于10%中性甲醛固定，HE染色，送病理檢查作組織切片。病理改變評分參考文獻［8］：脂肪變性評分：0(無)，1(肝細胞含脂滴小于25%)，2(肝細胞含脂滴26%～50%)，3(肝細胞含脂滴51%～75%)，4(肝細胞含脂滴大于75%)。根據匯管區、肝葉內炎癥細胞浸潤程度評分炎癥：0(無)，1(輕微)，2(輕度)，3(中度)，4(重度)。壞死評分：0(無)，1(輕微)，2(輕度)，3(中度)，4(重度)。

1.7統計學方法數據采用SPSS 13.0統計軟件包進行處理，計量資料以(χ±s)表示，采用單因素方差分析和Newman-Keuls檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

各組大鼠進食、進水良好，精神度好，清肝祛濕活血方各組灌胃反應較強烈，經解剖觀察食管破裂及肺部感染導致8只死亡(其中低劑量組和中劑量組各2只，高劑量組4只)；易善復組1只死亡，經解剖發現為尿路梗阻。最終81只大鼠采集到實驗數據。

2.1各組大鼠肝臟組織病理形態變化與評分變化空白組肝小葉結構完整，肝細胞索清楚，細胞核位于細胞中央,胞質豐富，肝竇排列規則，匯管區清晰，見圖1A。模型組肝小葉結構明顯紊亂，肝細胞索消失，肝竇消失，出現彌漫性肝細胞空泡樣變性,肝細胞變大，胞質內充滿脂滴，小葉內見局灶性肝細胞壞死，有明顯炎癥細胞浸潤，見圖1B。易善復組、低劑量組和中劑量組脂變程度較模型組減輕，空泡樣變肝細胞較模型組數目明顯減少，胞漿內僅見少量脂肪滴，小葉內局灶性肝細胞壞死，少量炎癥細胞浸潤，見圖1C、1D、1E。高劑量組脂變程度較模型組明顯減輕，肝小葉結構基本完整，肝索排列清楚，空泡樣變肝細胞明顯消失，胞漿內脂肪滴明顯減少，小葉內極少量炎癥細胞浸潤，見圖1F。病理改變評分見表1。

圖1　各組大鼠肝組織病理切片（HE×400）

表1　各組大鼠肝臟組織病理改變評分

2.2各組大鼠TG、TC及Srebp-1c變化與空白組比較，非酒精性脂肪肝大鼠TG、TC、Srebp-1c提高(P＜0.01)；與模型組比較，清肝祛濕活血方各劑量組TG、TC、Srebp-1c降低(P＜0.05)，高劑量組降低最顯著(P＜0.01)，見表2。

表2　各組大鼠TG、TC和Srebp-1c變化比較

3　討論

NAFLD主要是由于肥胖、糖尿病、高脂血癥、胰島素抵抗等臨床病癥累及肝臟引起病理學改變而造成［9］。其中關鍵影響因素之一是血漿游離脂肪酸(f ree fat ty acid，FFA)及甘油三酯(t riglyceride，TG)合成顯著增加。SREBP-1c屬于固醇調節元件結合蛋白(sterol regulatory element binding proteins，SREBPs)的一個亞型，主要參與脂肪酸代謝和糖代謝，是脂肪合成基因的主要轉錄調節因子。高脂飲食引起sREBP-1c表達增強，最初是一種適應性反應，隨著Srebp-1c表達進一步增強，導致脂肪酸代謝失衡，TG合成增多，與NAFLD的發生關系密切［9-10］。本研究顯示模型組SD大鼠通過高脂飼料喂養，腹腔注射四環素后Srebp-1c、TG、TC較空白組明顯升高；其肝臟病理切片可見肝小葉結構明顯紊亂，肝細胞索消失，肝竇消失，出現彌漫性肝細胞空泡樣變性，肝細胞變大，胞質內充滿脂滴，小葉內見局灶性肝細胞壞死，有明顯炎癥細胞浸潤。證實上述實驗造模成功。

Srebp-1c主要參與糖脂代謝，其高表達導致肝臟脂代謝異常，形成“初次打擊”［11］；脂肪組織炎癥是NAFLD發展的因素和病理表現［12-13］，且最終導致肝纖維化的發生［14］，形成“二次打擊”［11］。本研究結果表明，與模型組比較，清肝祛濕活血方各劑量組均能夠明顯降低NAFLD大鼠Srebp-1c、TG、TC水平，減輕脂肪組織炎癥，從而減少胞質內脂肪滴沉積，減少細胞變性，達到保護肝細胞、治療NAFLD的效果。

中醫認為NAFLD屬于“痰證”“濁毒”“積證”“脅痛”“肥氣”等范疇。基本病機為肝熱脾虛，痰濕瘀結［14-15］。其病位主要在肝，當地名醫王俊喹四診合參，并結合現代人群飲食習慣，認為NAFLD主要為肝經濕熱瘀阻所致，今人工作、生活壓力大導致肝氣郁結，久郁化熱，又兼嗜食肥甘厚膩而少動致脾虛濕盛，中焦氣機失調，濕與熱結，郁于肝經，經絡不通化為瘀血，發為NAFLD，故治療當清肝祛濕，活血通絡，依法自擬清肝祛濕活血方。方中夏枯草清肝涼血、垂盆草清利肝膽濕熱、郁金疏肝活血，共為君藥；密蒙花、青葙子助夏枯草清肝涼血；茵陳助垂盆草清肝膽濕熱；丹參助郁金涼血活血、且養心安神，共為臣藥；干姜溫中散寒、燥濕化痰，防寒涼傷胃，為佐藥。諸藥合用共奏清利肝膽濕熱，活血化瘀散結，溫中燥濕化痰之功。現代藥理研究表明［16］夏枯草含有三萜類、甾醇類等成分，有降血壓、降血脂、降血糖、抗氧化、抗自由基等作用，另外夏枯草還有調節內分泌的功能；垂盆草［17］具有保肝、免疫調節等作用；郁金［18］具有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集的作用。

本研究表明清肝祛濕活血通過減少NAFLD大鼠肝臟組織Srebp-1c蛋白表達，降低TG、TC，改善血脂代謝，同時此方還能夠減輕脂肪組織炎癥，減少胞質內脂肪滴沉積，減少細胞變性，對NAFLD有較好的治療作用。有研究表明［10］非酒精性脂肪肝大鼠Srebp-1c的mRNA表達變化先于肝臟組織學改變，本方是否通過減少肝臟組織Srebp-1c蛋白的表達改善肝臟組織學改變有待進一步研究。

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The Influenceof QingGan QuShi HuoXue Prescription on the Expressions of Srebp-1c of the Ratsw ith Non Alcoholic Fatty Liver D isease

ZHANG Yuxiang1，WANG Yiqiang1，JIANG Demin1，SHIXiaowei2△，WANG Junkui3
1 Gansu Provincial TCM School，Lanzhou 730050，China；2 Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine；3 Xihe County TCM Hospital

Objective：To explore the effectsof QingGan QuShi HuoXue prescription on the expressions of liver sterol regulatory elementbinding protein-1c（Srebp-1c）of the ratsw ith non alcoholic fatty liver disease（NAFLD）. Methods：A llSD ratswere random ized into the blank group，themodelgroup，phosphatidylcholine group，low，moderate and high doses groups of QingGan QuShi HuoXue prescription.A fter given conventional feed for seven days，the blank group accepted normal feed；other groups received high fatty feed and intraperitoneal injection of tetracycline to establish themodelsof NAFLD，for fourweeks，differentdosesgroups of QingGan QuShi HuoXue prescription were treated w ith QingGan QuShi HuoXue prescription，phosphatidylcholine group w ith rehabilitation therapy，themodel group and the blank group the same amountof distilled water after successfully establishing themodels. A ftermedicating for four weeks，pathological changes of liver tissue were observed，and the expressions of liver Srebp-1c were detected by Western Blotting method after detecting the blood lipid.Results：Compared w ith the model group，the levels of TG and TC decreased obviously in low，moderate and high doses groups of QingGan QuShiHuoXue prescription（P＜0.05）；liver fatty degeneration alleviated obviously；the expressions of liver Srebp-1c lowered notably（P＜0.01）.Conclusion：QingGan QuShi HuoXue prescription could down regulate the expressionsof liver Srebp-1c of the rats，which showsbettereffects in treating NAFLD.

non alcoholic fatty liverdisease；QingGan；QuShi；HuoXue；Srebp-1c

R575.5

A

1004-6852（2016）07-0019-04

2015-06-25

甘肅省中醫藥管理局項目（編號GZK-2015-7）。

張玉香（1982—），女，碩士學位，講師。研究方向：內科疾病的中醫藥防治。

史曉偉（1983—），男，碩士學位，主治醫師。研究方向：糖尿病及其并發癥的中醫藥防治。