半夏多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧作用研究

楊有林，齊武強寶雞市婦幼保健院藥劑科，陜西 寶雞 7000；寶雞市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科

半夏多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧作用研究

楊有林1，齊武強2
1寶雞市婦幼保健院藥劑科，陜西 寶雞 721000；2寶雞市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科

目的：通過響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶提取半夏多糖的工藝，并評價其抗氧化活性。方法：以半夏多糖得率為響應(yīng)值，以液料比、酶解溫度、酶解時間、復(fù)合酶（木瓜蛋白酶、纖維素酶、果膠酶的質(zhì)量比為2∶2∶1）添加量為試驗因素，采用響應(yīng)面法建立數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化提取條件；體外抗氧化活性考察半夏多糖對DPPH和O2-·自由基的清除能力。結(jié)果：通過二次回歸模型響應(yīng)面分析，酶解溫度、時間、復(fù)合酶添加量、液料比4因素對半夏多糖得率的影響依次減弱；酶解溫度與時間優(yōu)化為54℃和57分鐘，復(fù)合酶添加量為7.2mg/mL，液料比例為27∶1mL/g，在此最佳工藝條件下半夏多糖得率為27.98%，模型方程理論預(yù)測值為28.32%，兩者相對誤差小于5%。半夏多糖具有較強的抗氧化活性，對DPPH和O2-·自由基的半數(shù)抑制濃度分別為0.987mg/mL、1.309mg/mL，但與維生素C比較，抗氧化活性較弱。結(jié)論：采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到了半夏多糖的最佳復(fù)合酶提取條件，且半夏多糖有一定的體外抗氧化作用。

半夏；多糖；復(fù)合酶；響應(yīng)面；抗氧化

中草藥中多糖具有多種藥理活性，如抗氧化、抗炎性反應(yīng)、增強免疫等，且毒性小［1］，如山藥［2］、麻黃［3］、靈芝［4］、軟紫草［5］等中藥材都含有多糖成分。半夏［Pinellia ternata(Thunb.)Breit.］具有一定的藥用價值，富含多種有效活性成分。研究表明［6］，半夏多糖可抑制鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系增殖并誘導(dǎo)其凋亡，表明具有抗腫瘤作用；半夏多糖還可提高小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞表面MHC-Ⅱ表達(dá)，增強免疫反應(yīng)［7］。本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化半夏多糖的復(fù)合酶提取工藝，并探討其體外抗氧化作用。

1　材料與方法

1.1材料與試劑半夏購自中草藥市場，烘干至恒重備用；D(+)-無水葡萄糖(標(biāo)準(zhǔn)品)由大連美侖生物技術(shù)提供；DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，北京中生瑞泰科技)；木瓜蛋白酶、纖維素酶、果膠酶(上海士鋒生物科技)；維生素C(VC) Sigma(美國)；其他為分析純。

1.2半夏多糖提取半夏藥材粉碎后過100目篩，稱取篩后粉末5.0 g，按具體試驗需要的酶解條件，在搖床上進(jìn)行酶解提取多糖成分，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，酶解完成得到多糖浸提液。

1.3多糖測定通過苯酚-硫酸法測定多糖含量［8］。以D(+)-無水葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0148X-0.0387，R2=0.9932，方程式中X為葡萄糖質(zhì)量濃度，單位為mg/mL，Y為吸光度OD值。多糖得率計算公式為：D(%)=[(N×T)/Z]× 100，式中D為多糖得率(%)，T為多糖浸提液的體積(mL)，N為由回歸方程求得的多糖濃度(mg/mL)，Z為藥材半夏粉末的質(zhì)量(g)。

1.4響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計酶解pH 4.5、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min及復(fù)合酶比例(木瓜蛋白酶、纖維素酶、果膠酶的質(zhì)量比為2∶2∶1)［9］3個條件不變，因素水平設(shè)計及數(shù)據(jù)分析方法參考文獻(xiàn)［10］，數(shù)據(jù)分析采用Design-Expert軟件(Stat-Ease，Inc.)，見表1。

表1　半夏多糖提取條件優(yōu)化的因素水平值

1.5半夏多糖抗氧化活性研究自由基DPPH的清除能力測定：0.2mmol/LDPPH溶液與待測樣液等體積(各2mL)混合反應(yīng)0.5小時后，測其在517nm處的吸光度值，標(biāo)記為C1，測DPPH溶液與蒸餾水在517 nm處的吸光度值，標(biāo)記為C0，測乙醇與樣液在517 nm處的吸光度值，標(biāo)記為C2，同法測定對照維生素C的吸光度值［11］。

自由基O2-·的清除能力測定：詳細(xì)步驟參考文獻(xiàn)［10］，測定波長為325 nm的吸光度值，標(biāo)記為C1，蒸餾水替代樣品溶液后的吸光度值為C0，蒸餾水代替鄰苯三酚后的吸光度值為C2，同法測定對照維生素C的吸光度值，并進(jìn)行比較。兩種自由基的清除率計算公式均為：

2　結(jié)果與分析

2.1響應(yīng)面優(yōu)化

2.1.1試驗方案及結(jié)果試驗方案及結(jié)果見表2—3。

表2　試驗方案及結(jié)果

表3　試驗結(jié)果的方差分析

2.1.2方程建立與結(jié)果分析多糖得率(Y)與自變量的二次多項回歸擬合方程如下：

Y=27.39+0.12A-1.06B+0.95C-0.17D+1.89AB-0.59AC+0.087AD+1.05BC+1.40BD-1.16CD-1.55A2-2.37B2-1.66C2-1.35D2

由表3方差分析結(jié)果可知，模型方程達(dá)到顯著性(P＜0.0001)，失擬項不顯著(P=0.4319)，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.9141，總決定系數(shù)R2=0.9571，這些值表明此回歸方程模型成立，擬合程度好，試驗誤差小，可用于半夏多糖酶法提取工藝的優(yōu)化。此外，酶解溫度(B)、酶解時間(C)、復(fù)合酶添加量(D)、液料比(A)依次影響半夏多糖的得率，其中B、C達(dá)到顯著水平(P＜0.0001)，BC、AB、CD、BD交互作用均顯著(P＜0.01)。

2.1.3交互作用分析圖1中b、c表明AC、AD間交互作用對半夏多糖得率的影響不顯著，而圖1中a、d、e、f分別顯示AB、BC、BD、CD的交互作用顯著。回歸模型方程求解得到的最佳工藝參數(shù)為：復(fù)合酶酶解溫度53.9℃，酶添加量7.2 mg/mL，酶解時間為57.3分鐘，液料比為27.3∶1(mL/g)，此時半夏多糖得率達(dá)到28.32%，見圖1。

圖1　交互作用的響應(yīng)面圖

2.2驗證優(yōu)化后工藝將半夏多糖提取最佳工藝參數(shù)微調(diào)為：復(fù)合酶酶解溫度54℃，酶添加量7.2 mg/mL，酶解時間為57分鐘，液料比為27∶1mL/g，為檢驗響應(yīng)面法優(yōu)化后的工藝可靠性，此條件下平行進(jìn)行3組試驗，半夏多糖得率均值為27.98%，此值與理論預(yù)測值28.32%的相對誤差為1.20%。

2.3半夏多糖成分抗氧化活性研究半夏多糖濃度為8 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除率達(dá)到87.23%，但與VitC比較，DPPH清除能力差。半夏多糖清除DPPH的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.987 mg/mL，VitC的 IC50為0.706 mg/mL。半夏多糖濃度達(dá)到8mg/mL時，對自由基O2-·的清除率達(dá)到87.33%，但當(dāng)VitC濃度為2 mg/mL時，其對O2-·清除率為91.79%，故與VitC比較，清除O2-·的能力較弱。半夏多糖對自由基O2-·的IC50為1.309 mg/mL，VitC的IC50為0.627 mg/mL，見圖2—3。

圖2　半夏多糖對DPPH的清除能力測定

圖3　半夏多糖對自由基O2-·的清除能力測定

3　結(jié)論

魏淑紅［12］采用水提醇沉法提取半夏多糖的得率為13.68%。郭輝娟等［13］通過正交試驗確定纖維素酶法提取半夏多糖，得率最高達(dá)23.67%，多糖濃度為10 mg/mL時，其對羥自由基的清除率達(dá)到71.75%。但未見復(fù)合酶法及響應(yīng)面優(yōu)化法針對半夏多糖提取的工藝優(yōu)化。本研究通過響應(yīng)面優(yōu)化得到半夏多糖復(fù)合酶提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為復(fù)合酶添加量7.2mg/mL、酶解時間57分鐘、酶解溫度54℃、液料比27∶1mL/g，此時得到的多糖得率實際實驗值為27.98%，與理論預(yù)測值28.32%相對誤差小于5%，表明通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠。此外，半夏多糖對自由基O2-·和DPPH均有清除效應(yīng)，表明具有一定的體外抗氧化活性，但與VitC比較，清除這兩種自由基的能力較弱。

［1］ 安曉娟，馮琳，宋紅平，等.植物多糖的結(jié)構(gòu)分析及藥理活性研究進(jìn)展［J］.中國藥學(xué)雜志，2012，47（16）：1271-1275.

［2］ 于蓮，張俊婷，馬淑霞，等.山藥多糖提取工藝優(yōu)化及其抗菌活性研究［J］.中成藥，2014，36（6）：1194-1198.

［3］ 李友偉，溫東東，張雪敬.麻黃多糖提取工藝優(yōu)化［J］.中國藥業(yè)，2014，23（19）：49-52.

［4］ 闞永軍，吳建國，陳體強，等.BBD設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選靈芝多糖提取工藝［J］.中國藥房，2014，25（27）：2523-2526.

［5］ 李倩，田春芳，劉雯霞，等.超聲波復(fù)合酶法提取軟紫草多糖的工藝優(yōu)化［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2012，29（6）：498-503.

［6］ 曹書立，孟憲澤，魏品康.半夏多糖對希羅達(dá)干預(yù)下小鼠腺癌細(xì)胞 MHC-Ⅱ分子表達(dá)的增效作用［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10（11）：2034-2036.

［7］ 趙永娟，王蕾，侯琳，等.半夏多糖抗腫瘤作用研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2006，22（3）：368-371.

［8］ 李粉玲，蔡漢權(quán)，嚴(yán)贊開，等.酶法提取蘆根多糖的研究［J］.食品工業(yè)科技，2009，30（4）：156-159.

［9］ 劉紅梅，李棟，樊夢丹，等.灰樹花多糖的復(fù)合酶-微波提取、超濾純化及生物學(xué)評價［J］.中成藥，2011，33（4）：594-599.

［10］蔣德旗，黃利敏，王艷，等.響應(yīng)面優(yōu)化纖維素酶法提取桂花多糖及其抗氧化性［J］.食品工業(yè)科技，2015，36（2）：271-275.

［11］周立，劉裕紅，賈俊.復(fù)合酶法提取金銀花多糖工藝及其抗氧化性研究［J］.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2014，45（5）：646-650.

［12］魏淑紅.正交試驗法優(yōu)化半夏多糖的提取工藝［J］.生物技術(shù)，2010，20（2）：42-44.

［13］郭輝娟，魏定國.半夏多糖提取工藝優(yōu)化及其清除自由基能力研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，38（34）：19341-19342.

Study on Antioxidant Activity of Polysaccharide from BanXia and Extraction ProcessOptim ization

YANG Youlin1，QIWuqiang2
1 Pharmacy Departmentof BaojiMunicipality Maternity and Child-care Hospital，Baoji721000，China；2 Pharmacy Departmentof BaojiMunicipality TCM Hospital

Objective：To optimize complex enzymatic extraction technology of polysaccharide from BanXia （Pinellia ternata）by response surfacemethod，and evaluate itsantioxidantactivity.Methods：Polysaccharide yield ofBanXia was taken as the response，liquid tomaterial ratio，enzymatic hydrolysis temperature，enzymatic hydrolysis time and complex enzymes（mass ratios of papain，cellulose and pectase were 2：2：1）as experimental factors，mathematical model was established by adopting response surface method to optimize extraction conditions；antioxidantactivity in vitro was used to investigate the clearance ability of polysaccharide extracted from BanXia to DPPH and O2-·radical.Results：By analyzing with two regression model response surface，the influences of enzymatic hydrolysis temperature，enzymatic hydrolysis time，additive amount of complex enzymes and liquid to material ratio became attenuated gradually；enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis time were optimized as 54℃and 57m inutes，additive amount of complex enzymeswere 7.2mg/m L，liquid tomaterial ratio was 27：1m L/g，under the bestextraction technology，polysaccharide yield of BanXia was 27.98%，model equation theoretical prediction value was 28.32%，and relative error between both was less than 5%.Polysaccharide from BanXia presented strongerantioxidantactivity，halfmaximal inhibitory concentrations of DPPH and O2-radicalwere 0.987mg/m L and 1.309mg/m L，but its antioxidantactivity wasweaker compared w ith vitam in C.Conclusion：The best complex enzymatic extraction technology of polysaccharide from BanXia is obtained by adopting response surfacemethod，and the polysaccharide from BanXia showsantioxidantactivity in vitro to a certain degree.

BanXia；polysaccharide；complex enzyme；response surface；antioxidation

R283

A

1004-6852（2016）07-0037-05

2015-03-17

楊有林（1974—），男，主管中藥師。研究方向：中藥飲片的臨床應(yīng)用。