不同比例混合樣品對西瓜純度分子標記鑒定的影響

王吉明，尚建立，李 娜，徐永陽，馬雙武

（中國農業科學院鄭州果樹研究所 鄭州 450009）

西瓜純度鑒定在種質資源研究、新品種選育和生產應用上具有重要意義，傳統的西瓜純度鑒定方法為表型性狀鑒定，通過觀察西瓜表型性狀在生長發育期的變化而對純度做出判斷，受環境影響較大，存在鑒定周期長、準確性差、鑒定效率低等局限性［1-6］，而同工酶鑒定多態性不夠豐富，且有組織和器官特異性等缺點[7]。近年來隨著以PCR為基礎的分子標記技術的快速發展，不少作物實現了分子標記快速鑒定純度，將純度鑒定工作由田間轉移到室內，極大地提高了鑒定效率。在西瓜作物上前人先后開展過利用RAPD、SRAP、SSR等分子標記技術進行純度鑒定的研究［8-13］，其中基于全基因組測序信息開發的SSR核心引物為分子標記技術在西瓜純度鑒定上的實際應用提供了重要的支持［14］。

利用分子標記進行純度鑒定通常對樣品逐株進行分析，而在西瓜雜交種子純度鑒定工作中，雜株通常較少，如果通過將一定數量的單株混合后檢測混合樣品中是否存在雜株分子標記位點來對混合樣品的整體純度進行判定，可以大幅度減少鑒定工作量，如在小麥分子標記純度鑒定研究上通過合理混合樣品，將100粒種子的DNA合并為20個混合樣本，使工作量減少了4/5［15］，從而顯著提高了鑒定效率，但目前國內外在西瓜純度鑒定研究上尚未有類似的報道，為此筆者對不同類型的西瓜樣品混合后進行 dCaps（Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences，衍生型酶切擴增多態性序列）標記鑒定的比較研究，擬尋找合適的混合株數，為提高西瓜純度的分子標記鑒定效率提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2016年在中國農業科學院鄭州果樹研究所進行，材料來自西瓜甜瓜種質資源平臺（國家西瓜甜瓜中期庫）。以枯萎病抗性種質‘Su garlee’即“純株”和枯萎病感病種質‘14CB11’即“雜株”為材料，分別取新鮮真葉葉片和干燥真葉葉片備用。干燥真葉制備方法為：取新鮮真葉后置于國家西瓜甜瓜中期庫種質保存冷庫中（溫度5℃，相對濕度40%）低溫干燥72 h后成為干燥真葉。

1.2 方法

通過在‘Sugarlee’樣品（“純株”）中添加不同比例的‘14CB11’樣品（“雜株”），比較不同添加比例對分子標記純度鑒定結果的影響。

1.2.1 葉片混合樣品方法 按照表1進行不同比例的抗病材料和感病材料的真葉混合，其中新鮮真葉總混合樣品質量分為0.1g和0.5g，干燥真葉總混合樣品質量分為0.01g和0.05g，混合樣品后提取DNA。

表1 西瓜葉片量混樣比例表(雜株葉片量：總量混合葉片量)

1.2.2 DNA混合樣品方法 取0.1g新鮮真葉提取DNA，稀釋成100 ng·μL-1，按照感病材料提取DNA量占總混合 DNA 量的體積比為 1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 和 1∶100 進行 DNA 混合。

1.2.3 DNA提取方法 采用天根DNA提取試劑盒［天根生化科技(北京)有限公司生產］進行提取，提取方法以試劑盒操作說明書的步驟為主并略加改動，將操作說明書中第4步的GP2替換為預冷的異丙醇（0.7倍體積），采用 Nano Drop 1000（Thermo Scientific）微量紫外分光光度計檢測DNA濃度，將最終濃度稀釋到100 ng·μL-1左右。

1.2.4 dCaps反應 采用2×TaqMaster Mix（北京百泰客生物技術有限公司生產）進行PCR反應，反應體系為 25μL，包括 2×Taq Master Mix 12.5μL，模板DNA 2.0μL，10 mol·L-1，上、下游混合引物 2μL，ddH2O 8.5μL；擴增反應程序為94℃預變性5 min；94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，34個循環；72℃延伸5 min；4℃保存。

dCaps引物為國內公開發表的抗枯萎病生理小種1緊密連鎖的dCaps標記502124_fon[16]，該標記引物信息為：

上游引物序列為5′-AACACCACCCACTTTGGAGCTTCG-3′，下游引物序列為 5′-TTTTAGGGT GAAAATGGGTATTGTA-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

dCaps產物采用內切酶TaqI進行酶切，酶切識別位點為 T’CGA，酶切體系為：10×Buffer 1.5μL，限制內切酶 1.0μL；dCaps 擴增產物 5.0μL，ddH2O 7.5μL，總體系為 15.0μL。酶切程序為：65 ℃條件下酶切16 h，80℃條件變性20 min，4℃保存，限制性內切酶購自Fermentas公司。

2 結果與分析

全部混合樣品的DNA經dCaps擴增后均電泳出116 bp的條帶，該條帶被酶切后能夠產生94 bp的條帶，即“純株”抗病條帶，如經酶切后仍電泳出116 bp條帶，即“雜株”感病帶，表明樣品中混入的雜株被成功檢測（圖1）。

2.1 不同比例葉片混合樣品

2.1.1不同比例新鮮真葉混合樣品 根據電泳結果，在總量為0.1g新鮮真葉混合樣品中，感病葉片量與混合葉片總量混合比例為1∶2時116 bp的感病條帶最為清晰，隨著混合樣品比例的降低，116 bp條帶逐漸模糊，但直到最低的1∶20混合樣品比例時仍可以分辨出116 bp條帶。

當真葉混合總量提高到0.5g時，感病葉片量與混合葉片總量比例為1∶5和1∶10時，感病116 bp電泳條帶清晰可見，但當混合比例降低到1∶20時116 bp感病條帶消失，即無法進行雜株位點鑒定。

圖1 不同比例葉片混樣的dCaps電泳結果

2.1.2 不同比例干燥真葉混合樣品 在總量為0.01g干燥真葉混合樣品中，感病葉片量與混合葉片總量比例為 1∶2、1∶5 和 1∶10 時 116 bp 條帶清晰可見，當混合樣品比例降低到1∶20時仍可以分辨出116 bp條帶。

當干燥真葉混合總量提高到0.1g時，在1∶5和1∶10比例的混合樣品中，116 bp電泳條帶清晰可見，當混合樣品比例降低到1∶20則變為弱條帶，但是當混合樣品比例降低到1∶100時，感病條帶116 bp仍有模糊的痕跡。

2.2 不同比例DNA混合樣品

提取的DNA經過不同比例混合后進行了dCaps反應，在1∶5和1∶10比例的混合樣品中電泳出了清晰的116 bp條帶，當混合樣品比例降低到1∶20時變為弱帶，直到混合樣品比例降低到1∶50時弱帶仍然存在，混合樣品比例降低到1∶100時弱帶才完全消失。

2.3 不同類型混合樣品結果的比較

對干燥真葉混合樣品結果與新鮮真葉混合樣品結果進行比較發現，干燥真葉混合樣品后雜株位點可檢測的混合樣品比例更低，如干燥真葉雜株混合樣品比例為1∶20時雜株位點仍然可以識別，并且在1∶50仍有檢測條帶的痕跡，而新鮮真葉雜株混合樣品比例為1∶20時雜株位點條帶消失或模糊。

新鮮真葉經過DNA提取混合樣品后，在1∶50時仍有可檢測條帶的痕跡，與干燥真葉混合樣品效果類似，表明新鮮真葉經過干燥或DNA提取后再混合樣品可以提高雜株檢測靈敏度。

綜合以上不同混合樣品電泳結果分析，推薦雜株位點檢測最低混合樣品比例為1∶10，即10株可以為西瓜純度分子鑒定的可靠混合株數。

3 討論與結論

利用分子標記技術可以從DNA遺傳角度對西瓜純度進行分析和鑒定，能夠最大程度地排除環境因素對鑒定結果的影響，相較于傳統的田間表型性狀觀察鑒定具有明顯優勢，并且分子標記的技術特點具備了混合樣品分析的可能，通過合理混合樣品可以避免逐株進行分析，能夠減少鑒定工作量、提高鑒定效率。筆者通過不同質量的新鮮真葉混合、干燥真葉混合以及提取的DNA樣品混合，表明不同的樣品混合可鑒別的最低比例不太相同，最低的鑒定比例為1∶50，即最大混合株數為50株，在該混合樣品中只要存在1株雜株就可以識別出雜株的分子標記位點，一般的混合比例為1∶10，即混合株數為10株。綜合鑒定的穩定性和可靠性，推薦混合株數為10株，這個混合樣品數量與大豆混合樣品研究結果相似[16]，可作為實際混合樣品鑒定的參考混合株數，能夠將鑒定工作量縮短10倍左右。

不同樣品類型混合后鑒定的靈敏度不太一致，本試驗結果表明，干燥真葉混合比新鮮真葉混合效果好，而提取后的DNA混合比干燥真葉混合效果好，出現這種情況可能與混合樣品的均勻性有關，關于混合樣品方式的優化有待進一步比較和研究。