黃瓜枯萎病拮抗菌HM-7的鑒定

唐 蕊，張雪輝，殷世群，萬慧潔

（1.邢臺學院化學工程與生物技術學院 河北邢臺 054001； 2.邢臺市林業局 河北邢臺 054000）

黃瓜枯萎病是由半知菌亞門尖孢鐮孢菌黃瓜專化型[Fusarium oxysporum(Schl.)f.sp.cucumerinumOwen.]引起的一種嚴重的土傳病害，在黃瓜露地和保護地栽培中均有發生，是影響黃瓜生產最主要的病害之一。病菌從幼根或傷口侵入，危害維管束，阻礙水分運輸，使植株迅速萎蔫且病勢發展迅速，很難控制。發病率一般為10%～30%，嚴重時可達80%～90%[1-2]。近年來，該病的發生程度日趨嚴重，嚴重影響黃瓜的產量，導致經濟效益降低，造成巨大損失。目前生產上針對黃瓜枯萎病的防治除了選用抗病品種、結合輪作倒茬或嫁接等栽培管理等農業措施外，配合處理種子與土壤及發病初期施藥等化學防治方法進行綜合防治。化學藥劑主要有青枯立克、惡霉靈、甲霜惡霉靈等，雖然各種藥劑交替使用能有效緩解病菌抗藥性的產生，但長期使用導致許多菌株出現抗藥性，防治效果減弱；另一方面，化學藥劑的大量使用，也造成藥品殘留等食品安全問題。隨著人們經濟能力的提高、環保意識的加強，對食品質量提出了更高的要求，加之現代農業的發展和《食品安全法》的實施，農產品的安全生產顯得尤為重要。利用拮抗菌防治枯萎病屬于生物防治，對人畜無害、不污染環境、果實安全性高，成為專家學者研究的熱點。近年來主要研究的生防菌類群有真菌類的木霉、叢枝菌根，細菌類的芽孢桿菌、假單胞桿菌和放線菌類的鏈霉菌屬[3-4]。本研究在對黃瓜枯萎病拮抗菌篩選的基礎上，通過培養特征觀察、顯微觀察、革蘭氏染色、16S rDNA序列分析等對拮抗效果較好的拮抗菌HM-7進行鑒定，為生防制劑的研發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 拮抗菌HM-7（邢臺學院微生物實驗室從黃瓜種植園土樣中分離獲得，對黃瓜枯萎病拮抗效果顯著的菌株）。

1.1.2 培養基及試劑 牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，瓊脂 17g，水 1 000 mL。牛肉膏蛋白胨液體培養基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水 1 000 mL。馬鈴薯培養基（PDA）：馬鈴薯 200g，葡萄糖 20g，瓊脂 17g，水 1 000 mL。高氏 I號培養基：可溶性淀粉 20g，KNO31g，NaC1 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，瓊脂 17g，水 1 000 mL，pH 7.2～7.4。SK8255 基因組抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌HM-7菌株菌落特征觀察 采用平板劃線分離法。將活化的生防菌HM-7分別接種至牛肉膏蛋白胨培養基、PDA培養基、高氏I號培養基上，37℃培養，觀察不同時間其在不同培養基中的菌落特征。

1.2.2 顯微觀察和革蘭氏染色 選取生長24h的生防菌HM-7進行顯微觀察，并進行革蘭氏染色，在油鏡下觀察結果[5]。

1.2.3 拮抗菌HM-7基因組DNA的提取 將拮抗菌HM-7的單菌落接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在37℃中，200 r·min-1下震蕩培養過夜。取1 mL菌體培養液于EP管中，8 000 r·min-1離心1min，棄上清液。加入 20mg·mL-1的溶菌酶 180 μL，置于37℃水浴鍋中保溫1h，期間每10min混勻一次。加入蛋白酶K 20 μL，混勻后置于56℃水浴鍋中保溫30min，過程中每10min搖勻一次。加入20mg·mL-1的 RNA 酶 20 μL，室溫放置 3min。加入Buffer BD 200 μL，放置于70℃水浴鍋中水浴10min。加入200 μL無水乙醇，充分混勻，放置2min。12 000 r·min-1離心 1min，棄去液體。加入含異丙醇的 PW Buffer 500 μL，10 000 r·min-1離心30 s，棄上清液。加入含無水乙醇的Wash Solution，10 000 r·min-1離心 30 s，棄去液體，再離心 2min,棄去殘留液體，置于室溫晾干。加入100 μL的CE Buffer 12 000 r·min-1離心 2min，保存 DNA 溶液。過夜后，采用1.0%瓊脂糖凝膠80 V電泳檢測DNA，采集電泳圖像[6-8]。

1.2.4 16S rDNA序列的PCR擴增 將提取的生防菌HM-7基因組DNA進行16S rDNA的PCR擴增[6-8]。 PCR 擴增的 引物 27F：5’GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’；1492R：5’CGGCTACCTTGTTACGACTT 3’。PCR擴增體系：HM-7基因組DNA（100 ng·μL-1）1 μL，正向引物（4 nmol·mL-1）0.5 μL，反向引物（4 nmol·mL-1）0.5 μL，dNTP（10 mmol·mL-1）0.5 μL，10 倍Taq酶緩沖液 2.5 μL，Taq酶（2 U·μL-1）0.2 μL 加水至 25 μL。PCR 擴增程序為預變性94℃5min,變性94℃30 s，退火55℃35 s，延伸 72℃ 1min，35個循環，延伸 8min，擴增完成。采用1.0%瓊脂糖凝膠80 V電泳檢測DNA，采集電泳圖像。

1.2.5 PCR產物收集 將電泳結果PCR產物依據購自上海生工的回收盒標示的使用說明進行回收。

1.2.6 PCR序列測序分析 回收后的PCR產物寄送到生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將拮抗菌HM-7的16S rDNA測序結果在Blast（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）在線分析比對，利用MEGA 5.0中的Neighbor-Joining方法構建系統發育樹來鑒定HM-7分類地位，進化性分支模式的穩定性用MEGA 5.0中的Bootstrap分析。

2 結果與分析

2.1 生防菌HM-7培養特征觀察

牛肉膏培養基上生長初期，菌落呈米白色，邊緣光滑，有突起，水潤透明，不產色素。生長后期菌株呈乳白色，邊緣呈小波浪狀，有明顯的突起，褶皺，不產色素，菌株挑起時有拉絲，呈黏稠狀（圖1）。PDA培養基上生長初期與牛肉膏上相似，后期邊緣光滑，突起不明顯，菌落外緣有透明圈（圖2）。高氏Ⅰ號培養基上僅有很少量菌落生長。

圖1 牛肉膏培養基菌落

圖2 PDA培養基菌落

2.2 顯微觀察及革蘭氏染色

顯微鏡下油鏡觀察，生防菌HM-7菌株為短桿狀，具有運動性，革蘭氏染色呈陽性（圖3）。

圖3 革蘭氏染色油鏡觀察

2.3 分子鑒定結果

生防菌HM-7基因組DNA提取瓊脂糖凝膠電泳鑒定，采集圖像（圖4），參照分子量標準可知，HM-7的DNA大小在2 500 bp以上；16S rDNA基因的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳鑒定，采集圖像（圖5），參照分子量標準條可知16S rDNA片段的長度在1 500 bp左右。16S rDNA測序結果在NCBI上比對，生防菌HM-7與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloquefaciens）、枯草芽孢桿菌（B.subtilissubsp）、萎縮芽孢桿菌（B.subtilissubsp）相似度均達99%，與地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）相似度達98%。利用MEGA軟件構建出系統發育樹（圖6），HM-7與解淀粉芽孢桿菌處于同一分支，親緣關系更近。結合細菌生長形態觀察初步鑒定HM-7為解淀粉芽孢桿菌。

圖4 基因組DNA電泳圖

圖5 PCR產物電泳圖

圖6 拮抗菌HM-7系統發育進化樹

3 討論與結論

通過對培養特征觀察、顯微觀察、革蘭氏染色、16S rDNA序列分析，構建系統發育樹，初步鑒定拮抗菌HM-7為解淀粉芽孢桿菌。

由于微生物殺菌劑對環境污染小、果實安全性高，其發展趨勢與人類生態環境、食品安全和生物多樣性具有良好的相容性，加之現代微生物工業化生產技術的日趨完善，研發可替代化學殺菌劑的微生物殺菌劑是植物病害生物防治研究的重要方面。芽孢桿菌種群龐大，繁殖能力強，耐熱、耐酸堿，理化性質穩定，抑菌譜廣泛，是研究較為廣泛和深入的微生物類群之一，也是應用于植物病害生物防治的生防菌的主要來源之一。我國已研發成功并投入生產的生防芽孢桿菌商品制劑有百抗、麥豐寧、紋曲寧、伊天得、根腐消等[9-11]。本研究中的拮抗菌HM-7被初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌，而解淀粉芽孢桿菌是目前作為生防芽孢桿菌中的主要菌種之一，故其有望開發為生物制劑應用于農業生產。但拮抗菌HM-7的抑菌譜、拮抗物質穩定性、產生條件、分離提取以及拮抗機制等方面均有待進一步試驗探索。

隨著生物技術的發展，利用分子生物學技術導入拮抗基因研發工程菌株，或是采用誘變育種、原生質體融合育種等技術進一步獲得拮抗效果更加卓越的菌株，將成為生防制劑研發的新方向。