Rho鳥苷交換因子12（ARHGEF12）基因在白血病細胞生長中的作用研究

高莉，解楊陽，王翔，湯燕靜，湯靜燕，陳靜，沈樹紅

（上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心　血液/腫瘤科，上海　200127）

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Rho鳥苷交換因子12（ARHGEF12）基因在白血病細胞生長中的作用研究

高莉，解楊陽，王翔，湯燕靜，湯靜燕，陳靜，沈樹紅

（上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心血液/腫瘤科，上海200127）

目的：探討Rho鳥苷交換因子12（ARHGEF12）基因對白血病細胞生長的作用及作用機制。方法：通過實時熒光定量PCR（RT-PCR）對選定的U937、KG1a、ML2、Kasumi-1、THP1白血病細胞株進行ARHGEF12基因表達的檢測，并用shRNA分別在高表達及低表達的白血病細胞株中敲低ARHGEF12，通過流式細胞術分析細胞的生長及凋亡情況，最后進行蛋白激酶芯片分析以發現相關作用機制。結果：部分白血病細胞株高表達ARHGEF12基因，在高表達的細胞中敲低ARHGEF12基因會使細胞生長受抑制，這與敲低后細胞凋亡增加、增殖抑制相關，并且和p53、CDK2及p27 Kip1磷酸化相關。結論：ARHGEF12對其高表達的白血病細胞的生長是必須的，敲低ARHGEF12基因導致白血病細胞凋亡增加、增殖抑制。

ARHGEF12基因；白血病細胞；凋亡

Rho鳥苷交換因子12（ARHGEF12），也稱白血病相關的Rho鳥苷交換因子（LARG），是在1例急性髓細胞白血病中發現的MLL基因的融合伙伴基因［1］。ARHGEF12特異性催化與Rho家族成員RhoA結合的GDP和GTP進行交換，形成RhoA-GTP，從而激活RhoA并參與下游信號通路而發揮生物學功能［2］。Rho GTP酶也廣泛地參與正常造血過程，包括造血干/祖細胞的自我更新、歸巢及與骨髓微環境的相互作用

和各系血細胞的發育過程等；其異常表達和活化也與血液系統疾病密切相關［3-6］。研究［7］顯示，抑制RhoA及其下游的ROCK信號通路可抑制K562細胞生長。但到目前為止，ARHGEF12對白血病細胞的作用尚不清楚。本研究旨在通過對不同髓系白血病細胞株的研究，了解ARHGEF12對白血病細胞生長的影響并探討其作用機制。

1　材料和方法

1.1主要試劑 人急性髓系白血病U937、KG1a、ML2、Kasumi-1、THP1細胞株，293T細胞購自ATCC細胞庫或由其他實驗室贈予，由本實驗室傳代凍存。

RPMI 1640、DMEM、TRIzol購自美國Invitrogen公司；IMDM培養液購自美國Gibco公司；胎牛血清（FBS）購自美國Life Technologies公司；ARHGEF12及ABL基因引物由上海桑尼生物科技有限公司合成；反轉錄試劑盒購自大連Takara公司；qRT-PCR試劑盒購自大連Takara公司；ARHGEF12多克隆抗體、β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司；Annexin V/7AAD-A細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Becton Dickinson公司；嘌呤霉素（puromysin，PM）購自美國Thermo Fisher公司；脫靶shRNA質粒購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2細胞培養 U937、KG1a、ML2、Kasumi-1和THP1細胞用含10% FBS的IMDM培養液，293T細胞用含10% FBS的DMEM培養液，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱內傳代培養。

1.3RNA抽提 分別收集各細胞株［細胞計數為（5～10）×106/mL］的細胞，加入1 mL TRIzol，裂解后按說明書抽提RNA，置于-80 ℃保存。

1.4反轉錄合成cDNA 反應體系如下：5×Prime-Script RT Master Mix 2 μL；總RNA 500 ng；DEPC水補足至10 μL。反應條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃，10 min。

1.5實時熒光定量PCR（RT-PCR） ARHGEF12前向引物序列：5’-AGCCGTCATGACAACAGTGC-3’；ARHGEF12反向引物序列：5’-CTAACCCACTCTGGCGCAAC-3’；所用儀器為ABI 7900H，反應條件為：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；40個循環。

1.6shRNA質粒構建 靶向ARHGEF12基因不同位點的3個pLKO.1-puro shRNA質粒及脫靶shRNA質粒（作為對照組）用黃色熒光蛋白Venus序列替換了嘌呤霉素抗性原件。

1.7病毒包裝和轉染 質粒DNA通過鈣轉法轉入293T包裝細胞，轉染后48 h收集病毒上清。白血病細胞與病毒上清在纖維連接蛋白（retronectin，RN）包被的24孔板中孵育36 h后，用含10% FBS的RPMI 1640培養液重懸并繼續培養。

1.8ARHGEF12蛋白表達的Western Blot測定 分別收集轉染3個shRNA后72 h的細胞及對照（NT）組細胞，加入細胞裂解液，提取蛋白質，具體步驟參照文獻［8］。采用SDS-PAGE蛋白電泳進行分離，然后轉移至硝酸纖維素膜，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉1 h，分別用ARHGEF12抗體（1：500）、β-actin抗體4 ℃過夜，TBST洗膜3次。二抗用含2%脫脂奶粉的TBST室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，然后顯影曝光。

1.9 流式細胞術 分別收集轉染shRNA后3 d及7 d的白血病細胞及NT組細胞，用預冷的PBS洗滌細胞2次，用流式細胞儀檢測黃色熒光蛋白Venus陽性的細胞比例，取敲低組與NT組的比值。收集轉染puroshRNA后48 h的白血病細胞并用嘌呤霉素（終濃度2.5 μg/mL）處理3 d，用預冷的PBS洗滌細胞2次，再用1×binding buffer緩沖液配制成1×106/mL的細胞懸液。各取100 μL加入Falcon試管中，先加入Annexin V染料5 μL，避光10 min。用PBS洗滌1次，再加入7AAD-A染料5 μL，避光15 min，上流式細胞儀測定結果。

1.10蛋白激酶芯片分析 收集轉染puro-shRNA后48 h的Kasumi-1細胞，并用嘌呤霉素（終濃度2.5 μg/mL）處理3 d，經上海華盈生物醫藥有限公司進行蛋白激酶芯片分析（送樣細胞數量1×107）。

2　結果

2.1ARHGEF12在不同髓系白血病細胞株中的表達通過RT-PCR檢測ARHGEF12在ML2、Kasumi-1、U937、THP1和KG1a細胞中的表達水平，結果表明ARHGEF12

在Kasumi-1、U937和THP1細胞中表達量相對較高，而在KG1a細胞中表達量相對較低。見圖1。

圖1　ARHGEF12在不同髓系白血病細胞株中的表達

2.2ARHGEF12基因敲低效果 在Kasumi-1細胞中分別轉染了3個shRNA，通過Western Blot檢測ARHGEF12蛋白的表達，結果顯示相較NT組有明顯敲低效果，其中shRNA1效果最顯著。見圖2。

圖2　ARHGEF12蛋白在shRNA敲低后的表達

2.3敲低ARHGEF12抑制白血病細胞生長 分別在KG1a（ARHGEF12低表達）和Kasumi-1（ARHGEF12高表達）細胞中敲低ARHGEF12，采用流式細胞術分別檢測敲低后3 h及7 h活細胞數量，在Kasumi-1細胞中活細胞數明顯減少，細胞生長被抑制。以上結果表明ARHGEF12在其高表達的細胞中對維持細胞生長是必需的。見圖3。

圖3　敲低ARHGEF12后對2種白血病細胞生長的影響

2.4敲低ARHGEF12增加白血病細胞的凋亡 分別在ARHGEF12高表達的Kasumi-1和U937細胞中敲低ARHGEF12，采用流式細胞術分析敲低后第3天的凋亡指標Annexin V，在Kasumi-1細胞中3個shRNA都能明顯增加凋亡的細胞數，而在U937細胞中凋亡也有增加，但沒有Kasumi-1細胞明顯，Kasumi-1細胞用shRNA2敲低ARHGEF12后凋亡增加，見圖4-5。

圖4　敲低ARHGEF12后對2種白血病細胞凋亡的影響

2.5敲低ARHGEF12對下游信號通路的影響 在敲低ARHGEF12后第3天的Kasumi-1細胞中，從蛋白激酶芯片的結果顯示p53的第315位絲氨酸、CDK2第160位蘇氨酸及p27 Kip1第10位絲氨酸的磷酸化水平均較NT組上調。見表1。

圖5　Kasumi-1細胞用shRNA2敲低后的流式代表圖

表1　Kasumi-1細胞中敲低ARHGEF12后關鍵激酶磷酸化水平的變化

3　討論

本研究發現下調ARHGEF12能明顯降低白血病細胞中活細胞的比例，結合凋亡增加的表型，提示ARHGEF12在白血病細胞中主要通過調控凋亡途徑從而影響細胞的存活。蛋白激酶芯片的數據提示CDK2下游p53磷酸化上調，可能是對凋亡引起的DNA損傷的反應［9-10］。

文獻［11-12］報道p27 Kip1可與cyclin E.CDK2復合物結合，從而控制細胞周期及細胞生長，而p27 Kip1第10位絲氨酸磷酸化可促使細胞周期阻滯在G1期。因此，敲低ARHGEF12后細胞生長抑制很可能與p27 Kip1第10位絲氨酸磷酸化上調引起的細胞周期阻滯有關，本研究未進行細胞周期相關檢測，尚待進一步研究。

本研究選取的研究對象為白血病細胞株，發現ARHGEF12在不同髓系白血病細胞中的表達水平不盡相同，而在高表達的細胞中敲低該基因會導致細胞生長受抑制，這種抑制作用是敲低ARHGEF12后細胞凋亡增加及增殖抑制的共同結果，所以有必要在臨床樣本，尤其是急性髓系白血病病人樣本中檢測ARHGEF12的表達水平。對于ARHGEF12高表達的白血病患者，抑制ARHGEF12可作為一個潛在的治療靶點。

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（本文編輯：吳昔昔）

The role of Rho guanine nucleotide exchange factor 12 （ARHGEF12） in leukemia cell growth

GAO Li，XIE YangyangWANG XiangTANG YanjingTANG JingyanCHEN JingSHEN Shuhong.Department of Hematology and OncologyShanghai Children's Medical CenterSchool of MedicineShanghai Jiaotong University，Shanghai200127

ObjectiveTo assess the effect of ARHGEF12 on leukemia cell growth and the underlying mechanism.MethodsARHGEF12 expression was determined by quantitative RT-PCR in several leukemia cell lines.Knock-down of LARG was performed with shRNAs in leukemia cell lines and the flow cytometry analysis （FACS） was used to detect the growth and apoptosis of the leukemia cells after LARG silencing.Antibody assay screen of kinase phosphorylation was done to explore the potential mechanism.ResultsKnocking down ARHGEF12 in high expression cells would inhibit cell growthwhich resulted from increased apoptosis and decreased proliferation.Phosphorylation of p53CDK2 and p27 Kip1 were involved in this process.Conclusion：ARHGEF12 is essential for the growth of leukemia cellswith high expression of ARHGEF12downregulation of ARHGEF12 would cause increased cell apoptosis and inhibited cell proliferation as well.

ARHGEF12； leukemia cell； apoptosis

R733.7

ADOI10.3969/j.issn.2095-9400.2016.06.006

2016-02-18

國家自然科學基金資助項目（81270623）。

高莉（1988-），女，江蘇蘇州人，住院醫師，碩士。

沈樹紅，主任醫師，Email：sshfranks@126.com。