不同加速溶劑萃取條件對小球藻油脂提取的影響研究

周連寧，郝文龍，吳屬連，李 錕，王 波（.深圳海岸與大氣研究重點實驗室，廣東 深圳 58057；.深圳市深港產學研環保工程技術股份有限公司，廣東 深圳 58057）

不同加速溶劑萃取條件對小球藻油脂提取的影響研究

周連寧1，2，郝文龍2，吳屬連2，李 錕2，王 波1
（1.深圳海岸與大氣研究重點實驗室，廣東 深圳 518057；
2.深圳市深港產學研環保工程技術股份有限公司，廣東 深圳 518057）

采用響應曲面法對加速溶劑萃取法提取小球藻油脂過程的影響因素（萃取溫度、萃取時間、氯仿-甲醇體積比）進行研究。在試驗數據的基礎上，通過方差分析和多項式回歸構建擬合度良好的模型，模型顯著（P＜0.0001），失擬項不顯著（P=0.0821），R2=0.9917，R2adj=0.9811，能客觀科學地反映小球藻油脂的真實萃取情況。方差分析還表明，萃取時間對油脂提取量的影響達到極顯著水平（P＜0.0001），萃取溫度達到顯著水平（P=0.0496），氯仿-甲醇體積比則不顯著（P=0.5792）。橢圓形的等高線表明因素間存在兩兩相互作用，結合方差分析發現，萃取溫度和氯仿-甲醇體積比的交互作用達到極顯著水平（P=0.0057）。模型預測的小球藻油脂最高提取量為16.06%，對應各因素的水平為：萃取溫度132.37℃、萃取時間12.79 min、氯仿-甲醇體積比2.26∶1。此條件下的實際油脂提取量為16.10%，接近預測值。

小球藻；加速溶劑萃取法；響應面；生物柴油

周連寧，郝文龍，吳屬連，等. 不同加速溶劑萃取條件對小球藻油脂提取的影響研究［J］.廣東農業科學，2016，43（7）：126-132.

隨著經濟的發展，能源問題日益突顯，含油微藻作為一種清潔生物質能源受到極大關注［1］。含油微藻是一種很有潛力的生物柴油原料，具有生長快、含油高、不占用耕地等優點［2］。微藻油脂提取是產生物柴油的關鍵過程［3］，其提取方法的優化極為重要。Folch法［4］和Bligh-Dyer法［5］是兩種較經典、傳統的有機溶劑提取方法，兩種方法均采用氯仿甲醇溶劑系統，但溶劑配比不同。Sheng等［6］評估了多種溶劑及系統對集胞藻6803的油脂提取效率，發現基于氯仿-甲醇系統的Folch法和Bligh-Dyer法展現出最高的提取效率，可作為實驗室油脂提取方法的黃金標準。氯仿-甲醇對油脂的高效提取是因為該溶劑系統具有較好的細胞膜穿透能力和較合適的極性，并且其與氫鍵有較大的相互作用。當微藻細胞處于正已烷、氯仿等非極性有機溶劑中時，溶劑會穿過細胞膜與胞質中的中性脂質（如甘油三酯）通過范德華力相互作用，形成“有機溶劑-中性脂質”復合體，該復合體可順著有機溶劑濃度梯度擴散至細胞外圍的有機溶劑。部分中性脂質與胞質中的極性脂質（如磷脂、糖脂）形成復合體，并通過氫鍵與細胞膜上的蛋白緊密相連，非極性有機溶劑與中性脂質間的范德華力不足以破壞基于膜脂質與蛋白間的聯系，但甲醇這類極性溶劑可以。故氯仿-甲醇混合液可保證中性脂質的完全萃取，不論是以自由脂滴形式存在，還是以蛋白結合的復合體形式存在，在總脂萃取上展示了較高的效率［7］。雖然上述兩種經典的有機溶劑提取方法油脂提取效率較高，但提取過程中的有毒溶劑使用量較大，耗時也較長，因此有必要尋找更快捷高效的提取方法。有學者認為超臨界CO2萃取法可取代傳統的有機溶劑提取法［8-9］，因其采用超臨界CO2作為萃取溶劑，可快速提取油脂，而且避免使用有毒溶劑，具有環境友好性。但該法所用儀器昂貴，且對極性化合物的提取效率較低［10］。Richter等［11］于1996年研發出一套自動萃取的方法，即加速溶劑萃取法（Accelerated Solvent Extraction，ASE），該法用有機溶劑在高溫高壓下進行目標化合物的萃取，既提高了目標化合物的溶解度，加快了溶劑的擴散和物質的遷移，同時也降低了溶劑的粘度和表面張力。相比于傳統方法和超臨界CO2法，ASE法所用的溶劑量少，萃取時間短，且可自動化運行，還可保持樣品處于無氧無光的環境中，有效降低了萃取物的降解［12］。本研究采用前人方法中可高效萃取油脂的氯仿-甲醇溶劑系統，運用響應曲面法對ASE中影響油脂提取的參數進行了優化，為微藻生物柴油的發展提供參考。

1　材料與方法

1.1藻種培養與收集

供試藻種為小球藻（Chlorella sorokiniana），由深圳海岸與大氣研究重點實驗室保藏。

小球藻細胞置于液體BG-11培養基［13］，在恒溫光照搖床（TS2112B，上海秣馬恒溫設備廠）中持續光照培養，光照強度為2 000 lx，溫度為22℃，搖床轉速為80 r/min。培養至穩定期后，6 000 r/min離心2 min收集藻細胞，再用去離子水洗滌3次，獲得的濕藻泥用于油脂提取。

1.2小球藻含水率的測定

離心收集藻細胞，用去離子水清洗3次后稱量，記錄濕重為M1（mg），之后放入臺式冷凍干燥機（FreeZone 2.5 L，Labconco）中，冷凍干燥完成后再次稱量，記錄干重為M2（mg），計算含水率：

1.3小球藻油脂的提取

采用ASE法提取小球藻的油脂。稱取適量藻細胞，重量記為M3（mg），將其置于萃取池中，待溶劑充滿萃取池后，壓強升高并恒定為8 963.1841 kPa；之后加熱萃取池，進行靜態萃取；沖洗體積設為60%，萃取溶劑、萃取溫度、萃取時間則按后續實驗設計設置。收集的萃取液用旋轉蒸發儀蒸干大部分溶劑，剩余用氮氣吹干至恒重，稱量所得的油脂，記為M4（mg），計算小球藻油脂提取量：

1.4試驗設計

1.4.1單因素試驗設計 采用氯仿-甲醇雙溶劑系統萃取小球藻油脂，以小球藻油脂提取量為響應值，對可能影響提取量的因素（萃取溫度、萃取時間、氯仿-甲醇體積比）進行單因子3水平試驗，具體試驗設計見表1。

表1 單因素變量試驗因素水平

1.4.2響應面試驗設計 在單因素試驗基礎上，挑選各因素中油脂提取量較高的水平區間，運用Design Expert 8.0.6.1軟件中的Box-Behnken模型，以小球藻油脂提取量為響應值，進行3因素（萃取溫度、萃取時間、氯仿-甲醇體積比）3水平（-1、0、1）的響應面試驗設計，以期獲得最優參數組合，最大化油脂提取量。試驗各因素的水平賦值見表2。

表2 響應面試驗設計各因素水平

2　結果與分析

2.1小球藻含水率

試驗培養的小球藻分別于冷凍干燥前后稱重，通過公式計算得出離心收集的濕藻泥含水率為58.78%，作后續試驗參考。

2.2單因素試驗結果

2.2.1萃取溫度對小球藻油脂提取的影響 設定萃取時間為4 min，氯仿-甲醇體積比為1∶1，研究萃取溫度對小球藻油脂提取量的影響，結果見圖1。油脂提取量在130℃時達到最高，為8.12%。當萃取溫度不高于130℃時，隨著萃取溫度的上升，油脂提取量呈上升趨勢，這是因為高溫可提高油脂在有機溶劑中的溶解度，同時加快了油脂在有機溶劑中的擴散速率。值得注意的是，ASE的高溫是在高壓（8 963.1841 kPa）基礎上達到的，而高壓又能提高分子間共價鍵的穩定性，阻礙油脂的降解［10］，對油脂有一定的保護作用。本研究中，當溫度高于130℃時，油脂的熱降解效應較大，并且隨著溫度的升高而增加，最終導致了油脂提取量的下降。Sch?fer［14］在用ASE提取谷物、雞蛋黃和雞胸肌的脂肪酸時，得到了類似的規律，即隨著萃取溫度的升高，提取量呈先增加后降低的趨勢。

圖1 萃取溫度對小球藻油脂提取量的影響

2.2.2萃取時間對小球藻油脂提取的影響 設定萃取溫度為130℃，氯仿-甲醇體積比為1∶1，研究萃取時間對小球藻油脂提取量的影響，結果見圖2。隨著萃取時間的延長，油脂提取量逐漸上升后小幅下降。當萃取時間為12 min時，油脂提取量最高，為12.67%。說明油脂長時間暴露于高溫高壓環境中時，也會出現一定的降解。

圖2 萃取時間對小球藻油脂提取量的影響

2.2.3氯仿-甲醇體積比對小球藻油脂提取的影響 設定萃取溫度為130℃，萃取時間為12 min，研究氯仿-甲醇體積比對小球藻油脂提取量的影響，結果見圖3。油脂提取量最大為15.58%，此時氯仿-甲醇體積比為2∶1，與Folch法［4］的溶劑配比剛好相符。氯仿-甲醇體積比直接決定了混合液的極性，而溶質與溶劑的相互作用遵循極性相似原則，即極性相似的物質可以互溶，由此可推測小球藻細胞所含油脂的絕大部分，其極性與體積比為2∶1的氯仿-甲醇混合液相當。

2.3響應面優化試驗

圖3 氯仿-甲醇體積比對小球藻油脂提取量的影響

在單因素試驗基礎上，選擇各因素響應值較高的水平區間（如萃取溫度，選擇120～140℃），運用Design Expert 8.0.6.1軟件的Box-Behnken模型進行3因素3水平的試驗設計，得到17組試驗，結果見表3。從表3可以看出，各因素不同水平組合下的小球藻油脂提取量介于14.46%～16.06%之間。對所得的試驗數據進行多項式回歸擬合，得到小球藻油脂提取量對萃取溫度、萃取時間、氯仿-甲醇體積比的

表3 響應面試驗設計結果

回歸方程，即：

油脂提取量=16.01+0.066A+0.36B+0.016C+ 0.11AB+0.15AC+0.11BC-0.33A2-0.89B2-0.083C2。

對該回歸模型進行方差分析，結果見表4，模型P＜0.0001，達到極顯著水平，失擬項P=0.0821＞0.05，未達顯著水平，校正確定系數R2=0.9917，表明模型擬合度良好［15］，能較好地反映各因素水平對響應值的影響，可用于預測小球藻油脂提取量。3個因素中萃取時間對油脂提取量的影響達到極顯著水平，萃取溫度達到顯著水平，氯仿-甲醇體積比則不顯著。因素間兩兩交互作用響應面和等高線見圖4～圖6，其中等高線均為橢圓形，結合表4中交互作用的P值發現，3個因素兩兩交互作用對小球藻油脂提取量的影響均顯著。根據上述構建的回歸方程求解，獲得了最大小球藻油脂提取量，為16.06%，對應的最佳因素水平為：萃取溫度132.37℃、萃取時間12.79 min、氯仿-甲醇體積比2.26∶1。采用軟件預測的最佳條件進行試驗驗證，得到實際小球藻油脂提取量為16.10%，非常接近預測值，證明所建模型較好地預測了實際油脂提取情況。

表4 Box-Behnken試驗數據方差分析（ANOVA）

圖4 萃取溫度和萃取時間對小球藻油脂提取量的影響的響應面及等高線

圖5 萃取溫度和氯仿-甲醇體積比對小球藻油脂提取量影響的響應面及等高線

圖6 萃取時間和氯仿-甲醇體積比對小球藻油脂提取量影響的響應面及等高線

3　結論與討論

本研究構建了擬合度良好的模型，能科學客觀地加速溶劑萃取法中萃取溫度、萃取時間、氯仿-甲醇體積比對小球藻油脂提取的影響，模型預測的最佳組合為：萃取溫度132.37℃、萃取時間12.79 min、氯仿-甲醇體積比2.26∶1，預測的最大提取量為16.06%，實際試驗結果為16.10%，非常接近預測值，再次證明了模型的可靠性。

存量有限的石化能源持續被消耗，能源短缺日益加重，作為清潔可持續能源的微藻生物柴油備受矚目，但微藻生物柴油的技術瓶頸導致其工業化的成本相對較高，進程比較緩慢。ASE作為一種新型提取方法可快速完成油脂的高效萃取，同時對有機溶劑的需求量較小，大大降低了時間和物質成本，可以為微藻生物柴油的發展提供一定的助力。本研究用到的氯仿、甲醇溶劑雖可高效萃取油脂，但其毒性相對較大，故有必要尋找同樣高效且毒性較低的可替代溶劑來完善ASE，以加快微藻生物柴油的工業化進程。

［1］ Chisti Y. Biodiesel from microalgae［J］. Biotechnology advances，2007，25（3）：294-306.

［2］ de Boer K，Moheimani N R，Borowitzka M A，et al. Extraction and conversion pathways for microalgae to biodiesel：a review focused on energy consumption［J］. Journal of AppliedPhycology，2012，24（6）：1681-1698.

［3］ Cheng C H，Du T B，Pi H C，et al. Comparative study of lipid extraction from microalgae by organic solvent and supercritical CO2［J］. BioresourceTechnology，2011，102（21）：10151-10153.

［4］ Folch J，Lees M，Sloane-Stanley G H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues［J］. Journal of Biological Chemistry，1957，226：497-509.

［5］ Bligh E G，Dyer W J. A rapid method of total lipid extraction and purification［J］. Canadian journal of biochemistry and physiology，1959，37（8）：911-917.

［6］ Sheng J，Vannela R，Rittmann B E. Evaluation of methods to extract and quantify lipids from Synechocystis PCC 6803［J］. BioresourceTechnology，2011，102（2）：1697-1703.

［7］ dos Santos R R，Moreira D M，Kunigami C N，et al. Comparison between several methods of total lipid extraction from Chlorella vulgaris biomass ［J］. Ultrasonicssonochemistry，2015，22：95-99.

［8］ Babovic N，Djilas S，Jadranin M，et al. Supercritical carbon dioxide extraction of antioxidant fractions from selected Lamiaceae herbs and their antioxidant capacity［J］. Innovative Food Science & Emerging Technologies，2010，11（1）：98-107.

［9］ Zizovic I，Stameni? M，Orlovi? A，et al. Supercritical carbon dioxide essential oil extraction of Lamiaceae family species：Mathematical modelling on the micro-scale and process optimization［J］. Chemical Engineering Science，2005，60（23）：6747-6756.

［10］ Hossain M B，Barry-Ryan C，Martin-Diana A B，et al. Optimisation of accelerated solvent extraction of antioxidant compounds from rosemary（Rosmarinusofficinalis L.），marjoram（Origanummajorana L.）and oregano （Origanumvulgare L.）using response surface methodology ［J］. Food Chemistry，2011，126 （1）：339-346.

［11］ Richter B E，Jones B A，Ezzell J L，et al. Accelerated solvent extraction：a technique for sample preparation［J］. Analytical Chemistry，1996，68（6）：1033-1039.

［12］ Denery J R，Dragull K，Tang C S，et al. Pressurized fluid extraction of carotenoids from Haematococcuspluvialis and Dunaliellasalina and kavalactones from Piper methysticum ［J］. Analyticachimicaacta，2004，501（2）：175-181.

［13］ Wahlen B D，Willis R M，Seefeldt L C. Biodiesel production by simultaneous extraction and conversion of total lipids from microalgae，cyanobacteria，and wild mixed-cultures［J］. Bioresource Technology，2011，102（3）：2742-2730.

［14］ Sch?fer K. Accelerated solvent extraction of lipids for determining the fatty acid composition of biological material［J］.AnalyticaChimicaActa，1998，358（1）：69-77.

［15］ 歐陽輝，余佶，張永康. 纖維素酶提取湘西椪柑皮中總黃酮的工藝優化研究［J］. 食品科學，2010，31（12）：67-70.

（責任編輯 崔建勛）

Effects of different accelerated solvent extraction
conditions on lipids extraction from
Chlorella sorokiniana

ZHOU Lian-ning1，2，HAO Wen-long2，WU Shu-lian2，LI Kun2，WANG Bo1
（1. Shenzhen Key Laboratory for Coastal and Atmospheric Research，Shenzhen 518057，China）
（2. Shenzhen-HongKong Institution of Industry，Education&
Research Environmental Technique Co.，Ltd.，Shenzhen 518057，China）

Response surface analysis （Box-Behnken） was carried out to investigate the effects of three factors on lipids extraction from Chlorella sorokiniana using accelerated solvent extraction technique. Factors presented here were extraction temperature，extraction time and chloroform-methanol volume-ratio. Based on experimental data，ANOVA and quadratic regression reswts showed that， model was significant （P＜0.0001），in which lack of fit was not significant and R2was 0.9917，close to 1 and R2adj（0.9811）. ANOVA also indicated that the effects of extraction time and extraction temperature on lipids extraction were significant，while that of chloroform-methanol volume-ratio was not. Elliptic contour plots showed the presence of interaction between factors. The highest amount ofextract of predicted and experimental values were 16.06% and 16.10%，corresponding condition in which extraction temperature was 132.37℃，extraction time was 12.79 min and chloroform-methanol volume-ratio was 2.26∶1.

Chlorella sorokiniana；accelerated solvent extraction；response surface methodology；biodiesel

TK63

A

1004-874X（2016）07-0126-07

2015-12-29

國家自然科學基金（513080061006239）；深圳市科技計劃項目（JCYJ20140703164828240，JCYJ20140829093714177）

周連寧（1984-），男，碩士，工程師，E-mail：z.l.ning@163.com

王波（1979-），男，碩士，高級工程師，E-mail：wb@ierec.com