全基因組外顯子測序技術在遺傳性纖維蛋白原異常家系致病基因的克隆鑒定中的應用

劉曉娣　張新友　宋通微　洪澄英

[摘要]目的研究采用全基因組外顯子測序技術在遺傳性纖維蛋白原異常家系致病基因鑒定中的應用價值。方法采集12例遺傳性纖維蛋白原異常患者及其核心家庭成員外周血檢測凝血指標，并提取其基因組DNA進行全基因組外顯子測序，分析測序結果，探討遺傳性纖維蛋白原異常的分子機制。結果全基因組外顯子測序結果顯示：先證者A1、A4以及B2均為FGA基因g，1233G>A突變，A1的妹妹、A4的父親以及B2的母親均攜帶有相同的突變；A2、A7、B4和B5均為FGG基因g，10819G>A突變，家系成員中A2的母親和外婆、A7的姐姐和女兒、B4的母親和B5的母親均攜帶有相同的突變；A3、A5、A6、B1和B3及其相關親屬共10例攜帶有FGB基因g，9692A>G突變。先證者及家系主要成員中發生Fg基因突變的成員APTT、PT和TT均明顯延長，但Fg活性顯著降低。結論遺傳性纖維蛋白原異常可由多種Fg基因外顯子突變導致，FGB和FGG外顯子突變較為常見。

[關鍵詞]遺傳性纖維蛋白原異常；全基因組外顯子測序；家系致病基因；基因突變

[中圖分類號]R554.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]2095-0616（2016）03-33-04

纖維蛋白原（Fgrinogen，Fg）能夠在凝血酶作用下修飾成為纖維蛋白，在止血過程中發揮重要的生理作用，同時又可激活纖溶系統防止血栓的形成，Fg在集體出血與止血平衡中發揮重要的作用。遺傳性異常纖維蛋白原血癥（inheriteddvsfgrinogenemia）是人群中罕見的一種常染色體雜合顯性遺傳病，純合顯性遺傳者少見，該病發病率低，患者多數僅表現為輕微隱匿性癥狀。Fg基因較為復雜，從分子發病機制上方能很好地研究和診斷遺傳性異常纖維蛋白原血癥。本研究于2015年1～8月針對我院收集的遺傳性纖維蛋白原異常患者及其具有直接血緣關系的親屬和正常健康者，進行表型和基因分析，旨在從功能上探討遺傳性纖維蛋白原異常的分子發病機制。

1.資料與方法

1.1一般資料

選取遺傳性纖維蛋白原異常患者及其具有直接血緣關系的親屬和正常健康者參與本研究。其中，已確診的該疾病2個家系先證者共計12例，A家系7例，B家系5例先證者家系中的核心家系內成員共26例，A家系15例，B家系11例；正常健康者200例。12例先證者中有5例因消瘦原因就診，生化檢查表現為凝血酶原時間（PT）及凝血酶時間（TT）延長，活化部分凝血時間（Am）正常，纖維蛋白原（Fg）活性明顯降低；3例先證者無臨床癥狀，但易發生瘀斑、傷口愈合延遲，有自發流產史；4例先證者表現為經期經血過多，凝血較差，術前檢查為TT顯著延長，Fg活性下降。所有先證者平常均無自發出血、血栓病史，心腦、肝、腎功能均正常，所在家系中無近親結婚史，所有成員亦無自發出血、血栓病史，心腦、肝、腎功能均正常。

所有患者在采集血液等樣本和個人信息時均知情同意并簽字，本研究經我院倫理委員會同意批準進行。

1.2研究方法

1.2.1樣本收集及處理在知情同意的情況下，采集患者、家系成員靜脈血，以0.109mol/L枸櫞酸鈉1：9抗凝，4℃下1500rpm離心15min，將血漿-進行分裝于潔凈凍存管中進行標記，冷凍于70℃超低溫冰箱保存。提取所有研究對外周血細胞中基因組DNA進行外顯子測序，-80%保存備用。

1.2.2家系基因分析通過QIAGEN公司生產的QIAamp DNA Blood Mini Kit提取從采集的血漿樣本中提取研究對象的基因組DNA作為下步基因擴增的模板。家系基因分析采用測序方法找尋突變位點，測序方法為全基因組外顯子測序。

根據美國國家生物技術信息中心（NationalCenter of Biotechnology Information，NCBI）基因庫中公布的Fg基因序列（FGB ID：2244；FGA ID：2243；FGG ID：2266），利用Primer Premier 5.0軟件設計23對引物以覆蓋Fg基因的24個外顯子區域及其啟動子序列，其中FGA引物5對，FGB引物8對，GGG引物10對。將提取得到的DNA隨機打斷，將片段化的DNA分子在酶的作用下補齊隨機打斷造成的黏性末端而成為平末端，連接接頭，通過NimbleGen外顯子序列捕獲芯片捕獲目標外顯子區域，檢測其捕獲效率；然后對捕獲的目標片段進行PCR擴增，產物連接后隨機打斷，末端補平及加“A”堿基，連接測序接頭，PCR擴增并檢測序文庫的質量，最后利用illumina公司NextSeq 500測序儀進行測序。

PCR擴增反應體系為：上下游引物各1.5uL、模板DNA 2uL、dNTP混合物2uL、10×PCR反應緩沖液2.5uL、Taq DNA聚合酶0.2uL、無菌超純水15.3uL，總體積25uL。PCR擴增條件為：95℃預變性30sec→95℃變性30sec→52～63℃退火30sec→72℃延伸45sec。

1.2.3表型分析將采集的研究對象的外周血，以0.109mol/L枸櫞酸鈉1：9抗凝，4℃下3000rpm離心10min，取血漿檢測凝血酶原時間（PT）、活化的部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）、Fg活性。

2.結果

2.1家系基因分析結果

家系A和B中的12例先證者纖維蛋白原基因分析結果見表1，先證者A1、A4以及B2均為FGA基因第2外顯子g，1233G>A突變，A1的妹妹、A4的父親以及B2的母親均攜帶有相同的突變；A2、A7、B4和B5均為FGG基因第8外顯子g，10819G>A突變，家系成員中A2的母親和外婆、A7的姐姐和女兒、B4的母親和B5的母親均攜帶有相同的突變；A3、A5、A6、B1和B3及其相關親屬共10例攜帶有FGB第4外顯子g.9692A>G突變。家系其他成員及健康對照基因檢測均未發現異常。見表1。

2.2先證者及主要家系成員表型檢測結果

表2中為先證者及主要家系成員表型檢測結果，可見所有先證者APTT、PT和TT等三項凝血指標均有明顯延長，但Fg活性明顯降低。經全基因組外顯子測序確認發生基因突變的家系主要成員APqT、PT和TI"等三項凝血指標也存在明顯延長，Fg活性明顯降低的現象。其他家系成員和健康者四項指標均正常。

3.討論

纖維蛋白原由3條同源多肽鏈Aα、Bβ、γ聚合而成的六聚物（AαBβ γ），這三條多肽鏈分別由FGA、FGB和FGG基因編碼，且三個基因為同源基因，基因定位于4q28-4q31約50kb的染色體區域內，按5→3方向依次為FGG、FGA和FGB。三個基因中的任何一個發生突變均可導致纖維蛋白原出現數量及功能上異常，研究表明FGA基因突變占所有纖維蛋白原基因突變中的多數。纖維蛋白原異常對纖維蛋白肽釋放、聚集、穩定性、交聯，纖溶均能產生影響。遺傳性異常纖維蛋白原血癥是由于纖維蛋白原基因發生突變產生的一種纖維蛋白原結構和功能異常的遺傳性疾病，常表現為APTT、PT和TT等凝血指標延長、Fg活性降低等。目前，基因突變檢測是遺傳性異常纖維蛋白原血癥臨床診斷的金標準，但在臨床診斷時還需要分析其臨床表現、凝血功能指標和家系情況。

外顯子序列進展人類基因組序列的不足1%，單包含有85%以上的人類基因信息，人類多數遺傳疾病均是由于相應基因外顯子區域發生突變所致。全基因組外顯子測序技術是近年來發展起來的用于尋找人類基因致病基因及發病機制的一種方法，李斌等利用全外顯子組測序技術發現了基因c.1735 1736insT框移突變為Kallmann綜合征為新的疑似致病性突變。

本研究中，先證者A1、A4以及B2均為FGA基因第2外顯子g.1233G>A突變，A1的妹妹、A4的父親以及B2的母親均攜帶有相同的突變；A2、A7、B4和B5均為FGG基因第8外顯子g.10819G>A突變，家系成員中A2的母親和外婆、A7的姐姐和女兒、B4的母親和B5的母親均攜帶有相同的突變；A3、A5、A6、B1和B3及其相關親屬共10例攜帶有FGB基因第4外顯子g.9692A>G突變。先證者及家系主要成員中發生Fg基因突變的成員APTT、PT和TT均明顯延長，但Fg活性顯著降低。

FGA基因g.1233G>A突變能導致Aα中的Arg35被His或者Cys替代，是纖維蛋白原異常中最常見的突變，能使影響凝血酶對纖維蛋白原肽的釋放，抑制纖維蛋白聚合。FGB基因g.9692A>G突變可導致纖維蛋白原糖基之間可以通過相互排斥力使纖維蛋白網狀結構更加穩定，從而調節纖維蛋白形成，糖基化影響纖維蛋白初限位的相互交聯和纖維聚集，但由于這種改變沒有影響到主要的聚集位點，纖維蛋白未受到關鍵影響，患者多無臨床表現。FGG基因g.10819G>A突變常導致γ鏈中的Arg301發生變化。γArg301是纖維蛋白初纖維過程中D-D接觸面上的重要位點之一，對于纖維蛋白網狀結構形成所必需的，該位點的突變能夠影響纖維蛋白正常結構和聚集功能，多數突變基因攜帶者無臨床癥狀。

綜上，遺傳性纖維蛋白原異常可由多種Fg基因外顯子突變導致，FGB和FGG外顯子突變較為常見，這可能與地域有關。