胰腺癌細胞納米探針的磁共振熒光雙模態成像及抗腫瘤效果觀察

劉峰君， 葉　雯， 何欣源， 施裕新

上海市公共衛生臨床中心, 上海　201508

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·論著·

胰腺癌細胞納米探針的磁共振熒光雙模態成像及抗腫瘤效果觀察

劉峰君， 葉雯， 何欣源， 施裕新*

上海市公共衛生臨床中心, 上海201508

目的： 探討QDs@Gd-RGD納米探針用于MIA Ⅱ胰腺癌細胞磁共振(MRI)熒光雙模態成像的效果及其對胰腺癌細胞的抑制作用。方法： 構建QDs@Gd-RGD納米探針，將溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)的QDs@Gd-RGD納米探針(QDs@Gd-RGD組)、Gd(Gd組)分別與MIA Ⅱ胰腺癌細胞共孵育1 h，Control組不做處理，然后用熒光相差顯微鏡及1.5 T MRI儀觀察3組的成像特點。3組MIA Ⅱ胰腺癌細胞培養24 h后，觀察細胞形態、增殖、克隆、遷移、細胞周期、凋亡的變化。結果： 熒光相差顯微鏡下觀察發現，QDs@Gd-RGD納米探針分布于MIA Ⅱ胰腺癌細胞膜，而Gd組及Control組細胞膜及細胞內未觀察到熒光分布；1.5 T MRI成像顯示，QDs@Gd-RGD組信號強度明顯高于Gd組、Control組(P<0.05)。QDs@Gd-RGD組MIA Ⅱ胰腺癌細胞失去典型鋪路石樣形態、細胞核碎裂、細胞質空泡化，細胞克隆能力明顯下降，細胞增殖抑制，細胞遷移能力減弱，細胞周期明顯被阻滯，細胞凋亡增加(P<0.05)。結論： QDs@Gd-RGD納米探針用于MIA Ⅱ胰腺癌細胞MRI熒光雙模態成像的效果較好；QDs@Gd-RGD納米探針體外對MIA Ⅱ胰腺癌細胞有一定的殺傷作用。

胰腺癌細胞；QDs@Gd-RGD；MRI熒光雙模態成像；靶向診斷；抗腫瘤治療

胰腺癌發病較隱匿，早期診斷及治療比較困難，而且近年來胰腺癌的發病率及死亡率均逐年升高[1-3]。將新型納米醫學影像對比劑[4-6]與影像技術和熒光成像技術結合，即MRI熒光雙模態分子成像，成為近年來胰腺癌靶向診斷及治療的一種新方法。QDs@Gd-RGD納米探針能在胰腺癌細胞和分子水平進行MRI熒光雙模態分子成像的定性分析，并能同時觀察分子探針對細胞的影響。

RGD多肽是一類含有Arg-Gly-Asp的短肽，能拮抗αvβ3整合素[7-8]受體，進而介導細胞外基質與細胞及細胞與細胞之間的作用。研究[9-10]表明，αvβ3在腫瘤組織及腫瘤細胞中表達增加。 研究[11-13]表明，RGD多肽能誘導腫瘤細胞凋亡，在腫瘤靶向治療中發揮重要作用。因此，RGD多肽可作為特異性靶向標志物用于胰腺癌MRI熒光雙模態分子成像，還可作為αvβ3整合素受體拮抗劑抑制腫瘤生長，從而同時達到靶向診斷和治療的目的。

本實驗通過構建含QDs@Gd-RGD的納米探針，使其結合于表達αvβ3受體的MIA Ⅱ胰腺癌細胞表面，探討QDs@Gd-RGD納米探針用于胰腺癌細胞MRI熒光雙模態分子成像的效果及其對胰腺癌細胞生長及活性的影響，為在體胰腺癌腫瘤MRI熒光雙模態分子成像和藥物靶向治療提供實驗依據。

1　材料和方法

1.1主要材料及試劑MIA Ⅱ胰腺癌細胞株由上海市第十人民醫院消化內科惠贈；DMEM細胞培養液、胎牛血清及雙抗購自上海銳金生物醫藥科技有限公司；熒光倒置相差顯微鏡(DMI6000B)購自德國Leica公司；1.5 T MRI儀購自荷蘭Philips公司；RGD多肽購自上海楚肽生物科技有限公司。

1.2QDs@Gd-RGD納米探針合成將量子點采用PMAO和ED-600進行雙親性表面改性，使其由親油性轉變為親水性[14]。將5.0 nmol親水性量子點與500 nmol DOTA-NHS在1.0 mL硼酸鹽緩沖液中充分反應后，超速離心純化(100 000×g)，得到的QDs-DOTA納米顆粒用1.0 mL 磷酸鹽緩沖液(PBS，10 mmol/L)分散。稱取500 nmol 醋酸釓，溶解于1.0 mL去離子水中后，緩慢滴加到含QDs-DOTA納米顆粒PBS溶液中，使QDs-DOTA與Gd3+充分螯合后超速離心純化(100 000×g)，得到的顆粒分散在硼酸鹽緩沖液(50 mmol/L)中。將QDs@Gd3+、RGD、EDC按照摩爾比1∶10∶4 000于室溫反應2.0 h后離心(100 000×g)得到QDs@Gd3+-RGD雙模態納米探針。合成的QDs@Gd-RGD納米探針的尺寸、形態學特征、光譜學表征及弛豫性參見文獻[15]。

1.3細胞培養與分組將MIA Ⅱ胰腺癌細胞株用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養液在5%CO2、飽和濕度、37℃培養箱中培養。將細胞傳代后培養于24孔板，分成QDs@Gd-RGD組、Gd組、Control組，每組設3個復孔。前兩組分別加入100 μL含QDs@Gd-RGD納米探針(40 μmol/L)、Gd (40 μmol/L)的PBS，Control組不做處理。共孵育1 h后于熒光相差顯微鏡下觀察，并進行MRI成像。1.4熒光相差顯微鏡及MRI成像將3組細胞用PBS洗滌3～5次，鏡下觀察MIA Ⅱ胰腺癌細胞熒光分布情況。另將3組細胞用PBS洗滌3～5次，0.25%胰蛋白酶消化3～5 min，胎牛血清終止消化，然后用15 mL離心管離心5 min (150×g)，去除上清液，加入3 mL PBS洗滌，離心5 min (150×g)，于DMEM培養液中輕輕吹打成均勻的細胞懸液，置于2 mL Eppendorf管中行MRI掃描。采用1.5 T MRI進行T1WI序列掃描(20 s)，掃描條件為層厚5 mm、層距0.3 mm、TR/TE=2 000/120 ms、矩陣256×256、FOV：20×9.1。

1.5細胞增殖的觀察采用CCK-8法分析細胞增殖情況。將3組細胞分別接種于96孔板，在5%CO2、飽和濕度、37℃溫箱培養24 h后，用PBS反復洗3～5次。前兩組分別加入100 μL含QDs@Gd-RGD納米探針(40 μmol/L)、Gd (40 μmol/L)的PBS，Control組不做處理。培養24 h后取出培養箱，加入10 μL CCK-8 (5 mg/mL)，孵育4 h后，用多功能酶標儀測量 (Infinite M200 Pro, 瑞士Tecan 公司)測定D490值。

1.6細胞形態及細胞克隆3組細胞培養24 h后，用PBS反復沖洗3～5次，在熒光相差顯微鏡下觀察MIA Ⅱ胰腺癌細胞形態。然后，各組分別取200個細胞于培養板培養，7 d后，用PBS反復洗3～5次，用乙醇固定后加入結晶紫染色，再用PBS反復洗3～5次，拍照。顯微鏡下計數細胞的克隆數，計算克隆形成率，克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%。

1.7細胞遷移將3組細胞在5%CO2、飽和濕度、37℃溫箱培養24 h后，用PBS反復洗滌3～5次，用胰酶消化3～5 min，胎牛血清終止消化，然后離心5 min(150×g)，去除上清液，加入3 mL PBS洗滌后離心5 min(150×g)，去除上清液，加入培養液吹打成細胞懸液，置于Transwell板上室。24 h后，用乙醇棉球擦拭上室，固定10 min，加入結晶紫染色，用PBS反復洗滌3～5次，拍照。每組隨機選取5個放大倍數為200的視野，計算每組平均細胞數。細胞遷移百分數=遷移細胞數/細胞總數×100%。

1.8細胞周期及細胞凋亡將3組細胞在5%CO2、飽和濕度、37℃溫箱培養24 h后，用PBS反復洗滌3～5次，胰酶消化3～5 min，胎牛血清終止消化，然后離心5 min(150×g)，去除上清液，加入3 mL PBS洗滌，離心(150×g)，去除上清液，用培養液吹打成細胞懸液，加入相應抗體，在流式細胞儀上檢測細胞周期及凋亡情況。

1.9統計學處理應用SPSS 17.0軟件包進行統計。各組間比較采用多組獨立樣本的單因素方差分析，雙側檢驗。檢驗水準(α)為0.05。

2　結　果

2.1QDs@Gd-RGD MRI熒光雙模態成像QDs@Gd-RGD與MIA Ⅱ胰腺癌細胞作用1 h后，進行熒光及MRI成像。在熒光相差顯微鏡下觀察，發現QDs@Gd-RGD納米探針分布于MIA Ⅱ胰腺癌細胞膜(環形紅色熒光)，Gd組及Control組細胞未見明顯熒光(圖1A)。MRI成像顯示，QDs@Gd-RGD組MIA Ⅱ胰腺癌細胞的T1WI信號強度明顯高于Gd組及Control組(圖1B)；QDs@Gd-RGD組MIA Ⅱ胰腺癌細胞的T1WI信號弛豫率明顯高于Gd組及Control組(P<0.05，圖1C)。

2.2QDs@Gd-RGD的抗腫瘤作用

2.2.1細胞增殖培養24 h后，QDs@Gd-RGD組MIA Ⅱ胰腺癌細胞增殖抑制較其他兩組明顯(P<0.05，圖2)。

2.2.2細胞形態及細胞克隆培養24 h后，QDs@Gd-RGD組細胞失去典型鋪路石樣形態，細胞核碎裂，細胞質空泡化(圖3A)。培養板培養7 d后，QDs@Gd-RGD組MIA Ⅱ胰腺癌細胞的克隆數量最少(圖3B)；QDs@Gd-RGD組MIA Ⅱ胰腺癌細胞相對克隆形成率明顯低于Gd組及Control組(P<0.05，圖3C)。

圖1　3組MIA Ⅱ胰腺癌細胞的熒光及磁共振成像

圖2　CCK-8法分析3組MIA Ⅱ胰腺癌細胞的增殖情況

圖3　3組MIA Ⅱ胰腺癌細胞的形態及克隆

2.2.3細胞遷移QDs@Gd-RGD組MIA Ⅱ胰腺癌細胞遷移到Transwell板下室的細胞數量較其他兩組少(圖4A)，提示QDs@Gd-RGD納米探針減弱了腫瘤細胞的遷移能力。QDs@Gd-RGD組MIA Ⅱ胰腺癌細胞的遷移能力明顯弱于Gd組及Control組(P<0.05，圖4B)。

圖4　3組MIA Ⅱ胰腺癌細胞的遷移能力

2.2.4細胞周期培養24 h后，QDs@Gd-RGD組MIA Ⅱ胰腺癌細胞G2+M期阻滯較其他兩組更明顯(P<0.05)，說明QDs@Gd-RGD納米探針影響MIA Ⅱ胰腺癌細胞的細胞周期，使大部分細胞停留在G2+M期(圖5)。

圖5　流式細胞檢測示3組的MIA Ⅱ胰腺癌細胞周期改變

2.2.5細胞凋亡培養24 h后，QDs@Gd-RGD組MIA Ⅱ胰腺癌細胞晚期的凋亡率大于其他兩組(P<0.05，圖6)。

圖6　3組MIA Ⅱ胰腺癌細胞的凋亡情況

3　討　論

早期檢出及早期治療胰腺癌是提高生存率、降低死亡率的關鍵。隨著對疾病的認識從組織和細胞水平深入到分子、基因水平，近年來分子影像逐漸成為研究的熱點。隨著MRI成像及納米技術的發展，將兩者相結合的分子影像應用逐漸增多。此外，通過納米技術可將具有不同成像單元集成在一個納米載體上，合成具有雙或多模態成像功能的納米探針。

文獻[15-19]報道，RGD多肽作為腫瘤的潛在靶標，結合分子影像技術，將在腫瘤的早期診治、疾病監測方面發揮重要作用。腫瘤組織的新生血管中有大量αvβ3表達，而RGD多肽能拮抗αvβ3整合素受體，具有一定的腫瘤抑制作用。本實驗構建了弛豫性及結合效率良好的QDs@Gd-RGD納米探針，在體外進行胰腺癌細胞MRI熒光雙模態分子成像，并探討該探針對腫瘤細胞的殺傷作用。結果顯示，QDs@Gd-RGD納米探針能與MIA Ⅱ胰腺癌細胞膜結合，顯示環形紅色熒光，并能顯著增強胰腺癌細胞的MRI信號，為在體胰腺癌靶向顯像提供了實驗依據。

此外，研究[20]發現，外源性RGD多肽與腫瘤細胞膜表達的αvβ3結合后，可從多個環節發揮對腫瘤的抑制作用。研究[21]表明，RGD多肽配體與αvβ3受體結合后，阻滯細胞周期，導致腫瘤細胞凋亡。本研究也表明，QDs@Gd-RGD納米探針會導致MIA Ⅱ胰腺癌失去典型鋪路石樣形態、細胞核碎裂、細胞質空泡化，細胞克隆能力明顯下降，細胞增殖抑制，細胞遷移減弱，細胞周期阻滯，細胞凋亡增加。由此推論，QDs@Gd-RGD納米探針對腫瘤細胞有一定殺傷作用。

綜上所述，QDs@Gd-RGD納米探針不僅能用于MIA Ⅱ胰腺癌細胞MRI熒光雙模態分子成像，還能抑制腫瘤細胞的活性。結果提示，QDs@Gd-RGD可作為胰腺癌MRI熒光雙模態分子成像和藥物靶向治療的潛在納米探針。

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[本文編輯]姬靜芳

Effects of QDs@Gd-RGD nano probe on MRI and fluorescent dual-modality imaging of pancreatic cancer cellsand its anti-tumor role

LIU Feng-jun, YE Wen, HE Xin-yuan, SHI Yu-xin*

Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai 201508, China

Objective： To investigate the effects of QDs@Gd-RGD nano probe on fluorescent and MRI dual-modality imaging of MIA Ⅱ pancreatic cancer cells and its role in inhibiting pancreatic cancer cells. Methods： QDs@Gd-RGD nano probe was prepared. QDs@Gd-RGD nano probe (QDs@Gd-RGD group) and Gd (Gd group) were dissolved in phosphate buffer solution (PBS) and incubated with MIA Ⅱ pancreatic cancer cells for 1 h, and no treatment was given to the control group. And then imaging characteristics of the 3 groups were observed by fluorescence phase contrast microscope and 1.5 T MRI observation. After 3 groups of MIA Ⅱ pancreatic cancer cells were cultured for 24 h, cell morphology, proliferation, cloning, migration, cycle and apoptosis of MIA Ⅱ pancreatic cancer cells were observed. Results： Fluorescence phase contrast microscopy showed that the QDs@Gd-RGD nanoparticles were distributed in MIA Ⅱ pancreatic cancer cell membrane, while no cell membrane and cell fluorescence distribution was observed in the Gd group and the control group. 1.5 T MRI imaging showed that the signal intensity of QDs@Gd-RGD group was significantly higher than that of the Gd group and the control group (P<0.05). QDs@Gd-RGD group MIA Ⅱ pancreatic cancer cells lost the typical paving-stone morphology, nuclear fragmentation and cytoplasmic vacuolization took place, cell cloning ability decreased significantly, cell proliferation was inhibited, cell migration ability decreased, cell cycle was significantly blocked and cell apoptosis increased (P<0.05). Conclusions： QDs@Gd-RGD nano probe is effective in fluorescence and MRI dual modality imaging of MIA Ⅱ pancreatic cancer cells. Meanwhile, QDs@Gd-RGD nano probe has a certain killing effect on MIA Ⅱ pancreatic cancer cells.

pancreatic cancer cell; QDs@Gd-RGD; MRI and fluorescent dual-modality imaging; targeted diagnosis; anti-tumor therapy

2016-06-06[接受日期]2016-07-01

上海市科學技術委員會上海市自然基金青年項目(13ZR1459400). Supported by the Program of Science and Technology Commission of Shanghai Municipal for Young Scientists (13ZR1459400).

劉峰君，碩士，主治醫師. E-mail: liufengjun121@126.com

Corresponding author). Tel: 021-37990333, E-mail: shiyuxin@shaphc.org

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160671

R 735.9

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