家兔腦動脈粥樣硬化性狹窄模型的建立

田春鷗， 張　鑫， 袁　媛， 李子付， 張永鑫， 張　磊， 趙　瑞， 楊志剛*

1.第二軍醫大學長海醫院神經外科，上海　200433 2.解放軍第四二二中心醫院神經外科，湛江　524005 3.同濟大學醫學院，上海　200092 4.上海華佳醫院，上海　200433

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·論著·

家兔腦動脈粥樣硬化性狹窄模型的建立

田春鷗1,2△， 張鑫3△， 袁媛4， 李子付1， 張永鑫1， 張磊1， 趙瑞1， 楊志剛1*

1.第二軍醫大學長海醫院神經外科，上海200433 2.解放軍第四二二中心醫院神經外科，湛江524005 3.同濟大學醫學院，上海200092 4.上海華佳醫院，上海200433

目的： 探索建立穩定的家兔腦動脈粥樣硬化性狹窄模型的方法。方法： 將25只新西蘭大白兔隨機分成3組：對照組5只，普通飼料喂養，行股動脈切開手術；單純高脂飼料喂養組10只，高脂飼料喂養并行股動脈切開手術；高脂喂養聯合球囊損傷組10只，高脂飼料喂養并行經股動脈血管內椎動脈顱內段球囊損傷術。各組手術均在適應性喂養2周后實施，術后繼續以原飼料喂養。分別在術后2周和4周行目標椎動脈數字減影血管造影術(digital subtraction angiography，DSA)，并進行血脂水平檢測及病理組織學檢查。結果： 對照組與單純高脂飼料喂養組的目標椎動脈DSA及血管病理切片均未發現明顯差異。高脂喂養聯合球囊損傷組術后2周DSA提示，3例有目標段椎動脈輕度管腔狹窄，6例僅見管壁毛糙；術后4周DSA提示，5例可見目標段椎動脈管腔輕度狹窄，2例管腔中度狹窄，2例僅管壁毛糙。血脂水平檢測顯示，高脂喂養的兩個實驗組動物血脂水平高于對照組(均P<0.05)，單純高脂喂養組與高脂喂養聯合球囊損傷組的血脂水平差異無統計學意義。病理檢查提示，高脂喂養聯合球囊損傷組可見目標段椎動脈內皮結構紊亂，連續性中斷，內膜下見泡沫細胞沉積。結論： 通過高脂喂養聯合血管內球囊損傷，可成功建立較為穩定的家兔腦血管粥樣硬化性狹窄模型，為后續研究奠定了基礎。

家兔模型；球囊損傷；顱內動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化造成的腦供血動脈狹窄是發生缺血性卒中的重要原因之一。與西方人種不同，中國人腦供血動脈狹窄中，顱內狹窄所占比例較高[1-2]。顱內血管(包括頸動脈)與外周血管的結構明顯不同，且病理標本較難取得，又缺乏合適的動物模型。因此，與頸動脈粥樣硬化性狹窄相比，顱內動脈粥樣硬化性狹窄的相關研究比較滯后。為了深入研究顱內動脈粥樣硬化性狹窄，提高臨床療效，需要探索實用穩定的腦血管動脈粥樣硬化狹窄動物模型的建立方法。

本研究采用高脂飼料喂養聯合球囊損傷法，在家兔椎動脈顱內段模擬動脈粥樣硬化狹窄病變，從而建立一種新型的家兔腦血管粥樣硬化模型，以期為后續研究提供基礎。

1　材料與方法

1.1主要材料及試劑雄性新西蘭白兔25只，16～18周齡，體質量1.5～2.0 kg，由海軍醫學研究所動物中心提供[許可證號為SCXK(滬)2010-0029]。高脂飼料配方：基礎飼料75%、膽固醇5%、豬油11%、蛋黃粉8%、丙基硫氧嘧啶0.5%和膽酸鈉0.5%。球囊(商品名為Gateway，1.5/9 mm規格，即直徑為1.5 mm，長度為9 mm)購自美國Boston Scientific公司。碘海醇注射液(歐乃派克350)為通用電氣藥業(上海)有限公司產品。

1.2方法

1.2.1動物分組25只家兔隨機分為對照組(5只)、單純高脂喂養組(10只)和高脂喂養合并球囊損傷組(10只)。所有動物均在20～25℃、50%～70%濕度條件下單籠喂養，晝夜12 h循環。對照組動物給予基礎飼料(120～140 g/d)喂養，2個實驗組動物給予高脂飼料(120～140 g/d)喂養。適應性喂養2周，確認家兔狀態良好后建模。

1.2.2麻醉采用耳緣靜脈注射2%戊巴比妥鈉(20 mg/kg)的方法麻醉實驗動物。

1.2.3血管內皮球囊損傷動物取仰臥位，固定在手術臺上，常規備皮消毒鋪單，切開暴露股動脈，5F鞘置入股動脈內，鞘內注射100 U/kg肝素進行全身肝素化，5F導引導管在導絲的輔助下超選至右側椎動脈開口處，選用Gateway球囊在微導絲輔助下經導引導管超選至右側椎動脈顱內段，固定微導絲。在路圖下，緩慢充盈球囊(充盈壓力為3～4 atm，1 atm=101.325 kPa)，緩慢拖動球囊回撤移動5 mm，泄球囊。相同部位重復上述操作3次。撤出球囊，造影確認椎動脈通暢。撤出導引導管，拔除股動脈鞘，結扎術側股動脈遠近端，縫合皮膚。對照組及單純高脂喂養組僅行股動脈分離暴露及結扎；對照組同時取血，檢測血脂水平，作為血脂水平基線值。

1.2.4術后處理各組實驗動物在麻醉后給予青霉素5萬U單次肌肉注射以預防感染，手術后動物繼續以原飼料喂養。

1.3觀察指標

1.3.1影像學檢查各組動物于術后2、4周分別行數字減影血管造影術(digital subtraction angiography，DSA)。觀察家兔目標椎動脈的管壁情況及狹窄程度。狹窄程度分為輕度狹窄(<50%)、中度狹窄(50%～70%)及重度狹窄(70%～99%)。

1.3.2血液生化檢查于術后4周行DSA，各組家兔經耳緣靜脈抽取靜脈血，4℃離心(875 ×g)15 min，以獲得上層血清。檢測血清中總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白水平。

1.3.3組織學檢查術后4周DSA復查后，給予動物過量麻醉，用0.9%NaCl溶液以100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)通過左心室進行灌注，取主動脈弓及目標椎動脈以40%甲醛溶液固定，行組織病理學檢查，切片后行H-E染色及RAM 11兔單核細胞抗體染色分析。

2　結　果

2.1一般情況單純高脂喂養組中有1只動物在假手術后3 d開始納差、精神萎靡，1周后死亡，考慮感染可能。高脂喂養聯合球囊損傷組動物術中死亡1例，原因為超選過程中導引導管損傷，導致椎動脈開口處出血。其余動物手術過程順利，術后均健康存活。2.2DSA檢查結果術后2周腦血管造影提示，對照組及單純高脂喂養組的椎動脈顱內段無變化；高脂喂養聯合球囊損傷組的損傷局部均可見管壁欠光滑，內膜狹窄成功率為100%(9/9)，其中3例可見輕度管腔狹窄、6例無明顯管腔狹窄。

術后4周造影提示，對照組及單純高脂喂養組的椎動脈無明顯變化；高脂喂養聯合球囊損傷組的內膜損傷局部椎動脈管壁欠光滑，5例可見管腔輕度狹窄，2例管腔中度狹窄，狹窄模型的成功率為77.8%(7/9)，所有狹窄均為局限性狹窄(圖1)。

圖1　高脂喂養聯合球囊損傷家兔椎動脈造影

A：球囊損傷術后即刻造影，椎動脈顱內段顯影無明顯異常；B：球囊損傷術后2周造影，可見目標血管管壁略毛糙，管腔可見輕度狹窄(箭頭所示)；C：球囊損傷術后4周造影，可見目標血管管腔中度狹窄(箭頭所示)

2.3血液生化檢查血脂水平檢測結果見表1。對照組家兔術后4周血脂水平(包括總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白)與基線水平比較，無統計學意義(t值分別為2.59、1.42、2.75，P值分別為0.06、0.23、0.052)。3組間術后4周的血脂水平存在差異(Kruskal-Wallis檢驗，P<0.05)；單純高脂喂養組與高脂喂養聯合球囊損傷組血脂水平差異無統計學意義；兩實驗組家兔術后4周(即高脂喂養后6周)的血脂水平均高于對照組(Mann-Whitney檢驗，P<0.05)。2.4組織病理學檢查H-E染色結果提示，對照組與單純高脂喂養組目標椎動脈無粥樣硬化改變；與對照組相比，單純高脂喂養組主動脈內皮下可見泡沫細胞沉積，而椎動脈顱內段未見粥樣硬化改變。高脂喂養聯合球囊損傷組可見目標椎動脈內皮連續性中斷，內膜下見增大空泡樣細胞沉積，發生率為100%(9/9)；進一步行RAM 11兔單核細胞抗體染色，證實增大空泡樣細胞為泡沫細胞(圖2)。

表1　術后4周各組家兔的血脂水平比較　(，mmol/L)

基線值：取對照組術時血脂水平.*P<0.05與對照組相比

圖2　高脂喂養聯合球囊損傷組家兔椎動脈組織病理檢查

A, B：H-E染色20倍鏡(A)及40倍鏡(B)下視野觀察，可見椎動脈內皮連續性中段，內皮下大量空泡樣細胞；C, D：RAM11兔單核細胞抗體染色20倍鏡(C)及40倍鏡(D)下觀察，證實內皮下的空泡樣增大細胞為泡沫細胞

3　討　論

中國人顱內血管粥樣硬化性狹窄的發病率約為歐美人的3倍，因此深入研究顱內粥樣硬化性狹窄對提高中國人健康水平很重要。顱內血管內膜薄弱，缺少外彈力層，與外周血管結構明顯不同，兩者引起腦梗死的機制也有明顯差別[3-4]。因此，為加強對顱內血管動脈粥樣硬化的研究，建立顱內血管的粥樣硬化動物模型就顯得尤為重要。本研究綜合考慮成本及進行血管內干預治療的可行性后認為，家兔不僅有與人類相似的脂肪代謝過程，而且其具有對粥樣硬化的易感性及體型較小的優勢，因此可以將其作為合適的動物選擇。

單純高脂喂養可以造成家兔的血脂水平升高[5]，形成粥樣硬化，但粥樣硬化的形成部位多在大的彈性血管，且位置不固定。為了建立定位明確的動脈粥樣硬化模型，已有多項研究探索了在高脂喂養的基礎上附加其他處理的方法，如選擇性腔內球囊損傷內膜法、暴露并空氣干燥或液氮損傷局部血管內膜法、暴露后以電刺激血栓形成儀刺激或液氮刺激血管法等[6-9]，其核心均是造成血管內膜的定位性損傷。而對于顱內血管，暴露并直接觀察血管的做法不可取。隨著材料學的不斷進步，目前已有了可用于顱內血管的高順應性小規格球囊。本研究采用高脂喂養聯合高順應性球囊(Gateway)損傷內膜的技術建模，成功率為90%；局部血管造影可見病變，其中內膜不光整率為100%，管腔狹窄率達77.8%；病理檢查可見粥樣硬化改變率為100%，證明該建模方法具有較高的可行性。

對家兔的顱內血管進行損傷，有較高的技術要求。造模過程中需要注意以下幾個問題。(1)建議選擇右側椎動脈。與人類不同，家兔主動脈弓較窄，左側鎖骨下動脈開口與主動脈弓反向成角，導引導管不易穩定，而右側延長線則與胸主動脈的延長線幾乎呈直線關系，方便導管到位。(2)目標血管選擇椎動脈顱內段。本研究一開始曾嘗試選擇基底動脈，雖然基底動脈的直徑略大于椎動脈顱內段，但由于徑路較遠，家兔椎動脈直徑較細，導引導管無法到更高的位置。本研究中死亡的1例家兔即由于嘗試超選基底動脈的過程中未能提供更好的導引導管支撐，導致椎動脈開口處損傷出血。(3)顱內高順應性球囊是較好的球囊選擇。我們曾嘗試使用冠脈小球囊，但因為其順應性較差而無法到位。Gateway 1.5/9 mm是目前可用的最小規格的顱內球囊，雖然其直徑(1.5 mm)仍大于椎動脈顱內段直徑(平均略<1 mm)，但因其較高的順應性，可在較低的壓力下充盈，避免損壞血管。(4)動物的體位。在實際操作過程中，可以根據造影所見的血管角度，對家兔體位進行適當調整能提高到位的成功率。通常情況下，可使家兔的頭部適當左斜，由前肢向外下輕度牽拉，以拉直椎動脈前開口。(5)股動脈穿刺點的處理。進行血管內操作，一般需要5F的股動脈鞘管，故直接穿刺成功率較低。常規的方法是初次球囊損傷血管內皮及后續隨訪均切開股動脈置鞘，這樣會損傷雙側股動脈，給后續治療造成困難。因此本研究進行內皮損傷建模時切開股動脈置鞘，但隨訪時經耳緣靜脈造影，避免損傷家兔的另一側股動脈，為進一步的治療提供便利。這雖然導致影像質量略下降，但仍能滿足評估的需要。我們也嘗試設計了可以留置于一側股動脈的裝置。該裝置可以使內皮損傷建模及后續隨訪時重復利用同一血管，保證影像質量的同時保留對側股動脈。

本研究采用高脂喂養聯合低壓球囊損傷血管內皮的方法建立了腦血管粥樣硬化性狹窄的動物模型，雖然成功率較高，但狹窄程度較輕，難以造成目標腦動脈的重度狹窄，且本研究所建立的粥樣硬化模型的病理類型表現較單一，未見纖維性斑塊或鈣化以及壞死等粥樣硬化改變[10]。若加大高脂飲食中膽固醇的比例、延長高脂飲食時間，則常導致動物因脂質在多臟器內沉積，發生肝硬化而死亡。因此，采用何種方法制作病理類型更加多樣化且狹窄程度更重的腦血管粥樣硬化性狹窄動物模型，還有待進一步的探索。

綜上所述，本研究通過高脂飼料喂養聯合血管內膜球囊損傷的方法建立了腦動脈粥樣硬化性狹窄的家兔動物模型。該方法穩定、重復性較好、可行性高，可應用于顱內動脈粥樣硬化的實驗研究；但如何使模型的病理類型更類似人類，以及如何形成重度狹窄等問題還有待解決。

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[本文編輯]廖曉瑜， 張藝鳴

Development of atherosclerotic intracranial arterial stenosis model of rabbits

TIAN Chun-ou1,2△, ZHANG Xin3△, YUAN Yuan4, LI Zi-fu1, ZHANG Yong-xin1, ZHANG Lei1, ZHAO Rui1, YANG Zhi-gang1*

1.Department of Neurosurgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China 2.Department of Neurosurgery, No. 422 Hospital of PLA, Zhanjiang 524005, Guangdong, China 3.Tongji Medical College, Tongji University, Shanghai 200092, China 4.Shanghai Huajia Hospital, Shanghai 200433, China

Objective： To provide a simple and replicable method of building an atherosclerotic intracranial arterial stenosis model of rabbits.Methods： Twenty-five New Zealand white rabbits were randomly divided into three groups. Five rabbits in control group were fed with normal diet and received sham arteriotomy of femoral artery.Ten rabbits in pure high-fat diet group were fed with high-fat diet and received sham arteriotomy of femoral artery. Ten rabbits in balloon-injury group were fed with high-fat diet and underwent endovascular balloon-injury operation of intracranial vertebral artery through femoral artery. All the operations were performed after two weeks of adaptive feed. Each group was fed with previous diet after operation. Digital subtraction angiography (DSA) of target vertebral artery was performed two and four weeks after operation(four and six weeks after the scheduled diet). Serum lipid level was test and the histopathologic examinations were performed.Results： No significant difference was found by DSA or pathological detection of blood vessel in target vertebral artery of control group and pure high-fat diet group. DSA revealed the mild luminal stenosis in three cases and unsmooth inner wall in six cases at the target vertebral arteries in balloon-injury group two weeks after operation. Also the DSA revealed the mild luminal stenosis in five cases, moderate luminal stenosis in two cases and unsmooth inner wall in two cases in balloon-injury group four weeks after operation.Detection of serum lipid level showed that the serum lipid level of white rabbits in pure high-fat diet group and balloon-injury group was significantly higher than that in control group (P<0.05). No significant difference of serum lipid level was found between pure high-fat diet group and balloon-injury group. Histopathologic examination showed the disorder of endothelial structure in target vertebral arteries, interruption of endothelial continuity and deposition of foam cell under intima in the high-fat diet combined balloon-injury group. Conclusions： The method of high-fat diet combined with endovascular balloon-injury is beneficial to successfully build a relatively stable model of rabbits atherosclerotic intracranial arterial stenosis, and it provides the basis for further studies.

rabbit model; balloon injury; intracranial atherosclerosis

2016-01-06[接受日期]2016-07-11

上海市科技創新行動計劃實驗動物研究項目(13140903202)，上海市醫學引導項目(14411967600). Supported by Shanghai Science and Technology Innovation Action Plan for Laboratory Animal Research (13140903202)and Shanghai Medical Guidance Project(14411967600).

田春鷗，博士生，主治醫師. E-mail: tianchunou@126.com；張鑫，同濟大學醫學院臨床醫學專業2013級本科生. E-mail: zhang_xin9313@163.com

Corresponding author). Tel: 021-31166666, E-mail: renzh1979@163.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160023

R 543.12

A

△共同第一作者(Co-first authors).