單核苷酸多態(tài)性（SNP）在近交系小鼠遺傳檢測中的應用

趙麗亞， 張 蓉， 趙 瑩， 邢正弘， 陳國強（1. 上海西普爾-必凱實驗動物有限公司， 上海 201203； 2. 上海實驗動物研究中心， 上海 201203）

單核苷酸多態(tài)性（SNP）在近交系小鼠遺傳檢測中的應用

趙麗亞1，2， 張 蓉1，2， 趙 瑩1，2， 邢正弘1，2， 陳國強1，2
（1. 上海西普爾-必凱實驗動物有限公司， 上海 201203； 2. 上海實驗動物研究中心， 上海 201203）

目的 利用單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點構建多重聚合酶鏈反應和鏈接酶反應（PCR-LDR）方案，為近交系小鼠的遺傳檢測提供一種快速、簡便的方法。方法 在SNP公共數(shù)據(jù)庫中挑選51 個SNP位點，該51個位點分布于每條常染色體和性染色體，共分為5組，進行多重PCR-LDR方案構建，并將該方案作為遺傳質(zhì)量檢測方法對采集的7個近交系樣本進行檢測。結(jié)果 在送檢的7個近交系小鼠樣本中，純合度都為100%，相同來源相同品系小鼠的遺傳背景一致，但在不同單位的近交系小鼠中，某些SNP位點有差異，CBA/Ca/BKl和CBA/JSlac在a9、a10、b5、b9、c1、c12、e1、e2位點的遺傳檢測結(jié)果不同，C57BL/6/BKl和C57BL/6JSlac在c7、c10位點的遺傳檢測結(jié)果不同。另外，兩家公司各有5個位點在所有品系中基因型相同，因此有效位點數(shù)各為46個。結(jié)論 構建的多重PCR-LDR方案能有效對兩家動物生產(chǎn)單位的近交系小鼠進行檢測，可用于常見近交系小鼠快速、高通量的基因分型，有利于大規(guī)模遺傳質(zhì)量檢測和品系鑒定。

遺傳質(zhì)量檢測； 近交系小鼠； 單核苷酸多態(tài)性（SNP）； 多重聚合酶鏈反應和鏈接酶反應（PCR-LDR）； 分型方案

隨著C57BL/6及其它近交系［1，2］序列測序的完成，發(fā)現(xiàn)了大量單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms， SNP），SNP多態(tài)性及低檢測費用為遺傳鑒定提供了有利條件。2001年Grupe等［1］利用SNP檢測了15個品系， 2002年Wade等［2］利用SNP 從15個品系中檢測出4個品系是多態(tài)性， 2012年Cui等［3］利用SNP檢測了實驗小鼠的遺傳狀態(tài)， 2004年Petkov等［4］從235個SNPs中挑選28個SNPs用于鑒定48個小鼠品系。SNP數(shù)目多、分布廣， 遍布整個基因組， 具有遺傳穩(wěn)定性，SNP單核苷酸突變率為10-9。另外，SNP基因型分析特別適合模型動物的遺傳純度分析，等位基因位標包含了近交系小鼠中的所有信息，某些位于基因內(nèi)部的SNP變異有可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構或表達水平，因此SNP可用于描述近交系小鼠的遺傳狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇7個品系SPF級成年近交系小鼠，分別是上海西普爾-必凱實驗動物有限公司（以下簡稱BK公司）［SCXK（滬）2008-0016］提供的C57BL/6/BKl、C3H/He/BKl、FVB/NJ/BKl、BALB/c/BKl、DBA/2/ BKl、CBA/Ca/BKl、129/SvEvBrd/BKl和上海斯萊克實驗動物有限公司（以下簡稱BK公司）［SCXK（滬）2012-0002］提供的C57BL/6JSlac、C3H/HeJSlac、FVB/NJSlac、BALB/cAnSlac、DBA/2JSlac、CBA/JSlac，129S1/SVImJSlac， 每個品系分別從繁殖群和種子群中取雌雄各3～4只，兩家公司的繁殖群樣本都為56個，種子群樣本分別為55個和54個，共221個樣本。上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供的動物來源于英國BK公司，在國內(nèi)繁殖了約14代。上海斯萊克實驗動物有限公司提供的動物來源于Jackson實驗室，在國內(nèi)繁殖了約24代。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 使用動物基因組DNA抽提試劑盒（天根生化科技有限公司）， 從成年小鼠尾尖剪取0.5 cm組織用于抽取全基因組DNA，剪取的組織包括骨、血管、皮膚等各種組織，抽提產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后在Tanon-3500全自動凝膠成像分析系統(tǒng)上掃描，有結(jié)果時，可以作為模板用于后續(xù)的多重PCR擴增，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SNP位點引物與探針設計 從NCBI（National Center for Biotechnology Information）進入小鼠SNP公共數(shù)據(jù)庫，根據(jù)提供的小鼠品系，在每條染色體上選取1～3個SNP（short tandem repeat）位點，共挑選SNP位點51個［5］。

根據(jù)挑選的SNP序列，分別設計引物和探針，用primer3在線軟件（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）設計引物，選擇性擴增包含SNP位點的不同染色體區(qū)段。多重引物設計主要借助Oligo6.0程序（Molecular Biology Insights Inc.， USA）完成，同時將PCR-LDR產(chǎn)物的范圍設計在78～131 bp，每組內(nèi)各位點差異2 bp， 共設計引物和探針51對，將51對引物和探針分為5組，第1組為10個位點，第2組、第3組、第4組為12個位點，第5組為5個位點，并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成（表1、表2， 表中列出第一組的引物和探針序列，其余4組未列出引物和探針，只在結(jié)果中附圖）。

表 1 第一組PCR擴增引物序列Table 1 Genome primer sequences of the first group

1.2.3 PCR及LDR程序 PCR反應體系（10 μL體系）: 10×PCR緩沖溶液1 μL， GC 1μL， 25 mmol/L，Mg2+1.2 μL， 200 μmol/L的dNTP混合液（各2.5 mmol/L）0.8 μL， 各0.5 μmol/L的引物1 μL， 5個單位/μL熱啟動DNA聚合酶（AmpliTaq Gold?360 DNA Polymerase）0.05 μL， 3～5 ng/μL的模板DNA 1 μL，加水補足10 μL。

反應程序: 95 ℃ 15 min； 94 ℃ 30 s→50 ℃～65 ℃90 s→ 72℃ 1 min， 共35個循環(huán)； 72℃ 10 min； 10 ℃持續(xù)。其中第1組、第2組、第5組引物的退火溫度為56 ℃， 第3組引物的退火溫度為58℃， 第4組引物的退火溫度為60 ℃。

表 2 第1組LDR探針序列Table 2 Genome probe sequences of the first group

LDR反應體系（10 μL體系）: 10× 緩沖溶液1 μL，各0.5 μmol/L的位點特異探針1 μL，模板（PCR產(chǎn)物）4 μL，40 U/μL Taq DNA鏈接酶0.1 μL，加水補足10 μL。

反應程序：95 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s→50 ℃2 min，共30個循環(huán)；10℃ 持續(xù)。

1.2.4 多重PCR-LDR方案構建 取C57BL/6小鼠構建多重PCR-LDR方案，本實驗的多重PCR-LDR方案構建依據(jù)：①各LDR產(chǎn)物長度不同，相隔2 bp。②不同PCR引物或探針之間不發(fā)生相互作用以致影響某些PCR引物或探針的正常反應。因此將51個 SNP位點合理的分為5組，而后對每一組分別優(yōu)化PCR反應溫度、各引物間濃度比、各探針間濃度比等條件，使每組中所有位點都能被檢測出來，最后用5組PCR-LDR方案對待檢樣本進行檢測。該方法可將原來的11 271個反應過程縮減為1 105個PCR-LDR反應過程。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的檢測 質(zhì)量分數(shù)2%瓊脂糖電泳，電壓20 V/cm， 泳動方向：負極→正極， 泳動時間：40 min。溴化乙錠（15 μg/mL）染色，紫外燈下觀察， 拍照。

利用ABI3730自動測序儀（Applied Biosystems Inc.， 美國）對PCR-LDR連接產(chǎn)物進行毛細管電泳。具體過程是將1.0 μL LDR連接產(chǎn)物、1.0 μL ROX分子量標準和8 μL HIDI混勻后，95 ℃，5 min變性，立刻置冰水浴5 min，然后通過ABI3730自動測序儀進行檢測，每輪分析48個樣本，每輪運行時間為900 s。通過GeneMapperID v3.2軟件分析可將各種激光標記的DNA電泳帶轉(zhuǎn)變成相應的掃描吸收峰。再通過與已知分子量標準的內(nèi)參比較，確定LDR連接產(chǎn)物大小。

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因組DNA抽取

根據(jù)動物基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，挑選部分品系的抽提產(chǎn)物用質(zhì)量分數(shù)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后在Tanon-3500全自動凝膠成像分析系統(tǒng)上掃描（圖1），有結(jié)果時，可以作為模板用于后續(xù)的多重PCR擴增。

M: Marker； 第1道至第5道分別為C57BL/6/BKl、C3H/ He/BKl、FVB/NJ/BKl、BALB/c/BKl、DBA/2/BKl圖 1 基因組DNA 檢測結(jié)果Figure 1 The results of genomic DNA

2.2 多重PCR-LDR方案構建

取本實驗室中的C57BL/6/BKl為模板，構建多重PCR-LDR方案，最終將51個SNP位點組合為5組進行多重PCR-LDR擴增，第1組為10個位點（圖2A），第2組、第3組、第4組為12個位點（圖2B， C， D）， 第5組為5個位點（圖2E）。PCR-LDR結(jié)果表明，C57BL/6/BKl小鼠DNA在目標SNP位置均為單峰，表明其為純合子。

2.3 近交系小鼠遺傳檢測

在送檢的7個近交系中，采用51個SNP位點檢測，其純合度都為100%，相同來源相同品系的SNP狀態(tài)完全一致，但在不同單位的近交系小鼠中，某些位點有差異，主要有差異的品系及位點是：CBA/Ca/BKl和CBA/JSlac在a9、a10、b5、b9、c1、c12、e1、e2位點的遺傳檢測結(jié)果不同，C57BL/6/BKl和C57BL/6JSlac在c7、c10位點的遺傳檢測結(jié)果不同（表3）。

2.4 SNP位點在品系間的差異分析

品系間兩兩比較見表4、表5，BK公司各品系間最大差異位點數(shù)為30個，最小差異位點數(shù)為7個， 平均差異位點數(shù)為23個。SLAC公司各品系最大差異位點數(shù)為31個， 最小差異位點數(shù)為1個，平均差異位點數(shù)為23個。另外， 兩家公司各有5個位點在所有品系中基因型相同，分別為a4、b11、c7、c8、d9和a4、b11、c8、d9、e2，因此有效位點數(shù)各為46個。

3 討論

在醫(yī)學生物研究中，實驗動物遺傳質(zhì)量對實驗結(jié)果的可比性、可重復性和準確性有著重要影響。在長期保種、育種過程及繁殖生產(chǎn)中，近交系動物可能發(fā)生遺傳污染或遺傳突變、漂變，從而影響相關實驗結(jié)果的科學性、可靠性。所以加強對近交系小鼠進行長期、有效、嚴格、定時的遺傳學檢測非常重要。近交系小鼠傳代中產(chǎn)生變異的主要原因有基因突變以及遺傳污染。本研究提出利用多重PCR-LDR基因分型方案，多個位點可以在同一體系內(nèi)進行多重PCR擴增、LDR連接與分型，從而降低了費用。另外，通過對7個品系的近交系小鼠進行遺傳檢測，構建一種可檢測近交系小鼠的方案，可一次性檢測所有待檢樣本，并可進行品系間鑒定，有利于動物生產(chǎn)單位的近交系小鼠常規(guī)遺傳檢測。

本實驗應用51個SNP位點較全面的反應了小鼠的遺傳背景。將這51個SNP位點在7個品系小鼠中的連接產(chǎn)物進行比對，結(jié)果各品系基因純合度都為100%，說明其在傳代中沒有出現(xiàn)變異現(xiàn)象。但兩家公司的CBA/Ca/BKl和CBA/JSlac在a9、a10、b5、b9、c1、c12、e1、e2位點的遺傳檢測結(jié)果不同，C57BL/6/BKl和C57BL/6JSlac在c7、c10位點的遺傳檢測結(jié)果不同。原因可能是兩家公司動物來源不同，亞系不同。據(jù)報道， 2009和2015年Mekada等［6，7］利用SNP檢測C57BL/6的不同亞系，因來源不同，其基因型有差別， 2011年Zurita等［8］利用1 449個SNP檢測了C57BL/6的不同亞系，本文的結(jié)果與文獻報道一致。

圖 2 PCR-LDR分型方案的毛細管電泳圖Figure 2 The capillary electrophoresis of products by PCR-LDR

表 3 近交系小鼠遺傳檢測結(jié)果Table 3 The result of genetic monitoring of inbred mice

表 4 BK公司小鼠SNP位點品系間差異Table 4 The difference of SNPs in mouse from BK Co. strains

表 5 SLAC公司小鼠SNP位點品系間差異Table 5 The difference of SNPs in mouse from SLAC Co. strains

同時，實驗數(shù)據(jù)還表明各品系小鼠在某些位點表現(xiàn)一致，如a4、b11、c7、c8、d9或a4、b11、c8、d9、e2在所有品系中的基因型都相同，反應出小鼠品系間有相近的親緣關系，而在某些位點的不同結(jié)果也體現(xiàn)出了不同品系的特異性。另外，兩個公司品系間兩兩比較后，平均差異位點數(shù)都為23個。因此，通過對7個品系的近交系小鼠進行遺傳檢測，得到一種可檢測近交系小鼠的方案，可一次性檢測所有待檢樣本，并可進行品系間鑒定。該方案不僅節(jié)約了檢測時間及成本，更有利于對大規(guī)模樣本的檢測，將會擁有更加廣闊的發(fā)展前景。

［1］ Grupe A， Germer S， Usuka J， et al. In silico mapping of complex disease-related traits in mice［J］. Science， 2001， 292（5523）: 1915-1918.

［2］ Wade CM， Kulbokas EJ 3rd， Kirby AW， et al. The mosaic structure of variation in the laboratory mouse genome［J］. Nature， 2002， 420（6915）:574-578.

［3］ Cui SF， Zhou Q， Qu XH. SNP genotyping for the genetic monitoring of laboratory mice by using a microarray-based method with dualcolour fluorescence hybridisation［J］. HYPERLINK “http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ 22943516”o “Alternatives to laboratory animals: ATLA”. 2012， 40（3）:155-163.

［4］ Petkov PM， Cassell MA， Sargent EE， et al. Development of a SNP genotyping panel for genetic monitoring of the laboratory mouse［J］. Genomics， 2004， 23（1）:4-20.

［5］ The Jackson Laboratory. Mouse Genome Database （MGD）at the Mouse Genome Informatics website［DB/OL］. http:// www.informatics.jax.org.

［6］ Mekada K， Hirose M， Murakami A， et al. Development of SNP markers for C57BL/6N-derived mouse inbred strains［J］. Exp Anim， 2015， 64（1）:91-100.

［7］ Mekada K， Abe K， Murakami A， et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains［J］. Exp Anim， 2009， 58（2）:141-149.

［8］ Zurita E， Chagoyen M， Cantero M. Genetic polymorphisms among C57BL/6 mouse inbred strains［J］. Transgenic Res，2011， 20（3）:481-489.

Application of Single Nucleotide Polymorphism Genotyping Panel in Genetic Monitoring of Laboratory Mice

ZHAO Li-ya1， ZHANG Rong1， ZHAO Ying1， XING Zheng-hong1， CHEN Guo-qiang1
（1. Sino-British SIPPR/BK Laboratory Animal Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China；
（2. Shanghai Laboratory Animal Research Center， Shanghai 201203， China）

Objective To develop multiple PCR-LDR genotyping protocols for monitoring genetic contamination in inbreed mice in a fast and reliable way. Method In total 51 single nucleotide polymorphisms （SNPs） from public SNP database were chosen and divided into five groups. These 51 SNPs are wildly distributed and there are least one SNP on each autosomal chromosome and the sex chromosome. A multiple PCR-LDR genotyping protocol was established as a genetic quality control approach to monitor the genotypes of 7 inbred mice. Results The homozygosity is 100% for the 7 tested mice. The genetic background of the inbred mice from the same source is identical. For the same inbred mice from different companies， several SNPs are different. The SNPs are different at a9、a10、b5、b9、c1、c12、e1、e2 for CBA/Ca/Bkl and CBA/JSlac， while the SNPs are different at c7， c10 for C57BL/ 6/BKl and C57BL/6JSlac. However， there are five loci which are the same in the 7 inbred mice of different companies. So there are 46 effective loci which are different in the 7 inbred mice of different companies. Conclusion The multiple PCR-LDR genotyping protocol is used to monitor the genetic differences of inbred mice from two companies. The results of this study provide a rapid and highthroughput genotyping approach， which is sufficient for genetic contamination monitoring and strain identification.

Genetic quality monitoring； Inbred mice； Single Nucleotide Polymorphisms （SNP）；multiple PCR-LDR； Genotyping protocol

Q95-33

A

1674-5817（2016）01-0024-08

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.01.005

2015-06-29

上海市科學技術委員會科研計劃項目（12140900400）

趙麗亞（1981-）， 女， 碩士。研究方向: 分子遺傳學。E-mail: zhaoliya3002@163.com

趙 瑩（1982-）， 女， 碩士， 助理研究員。研究方向:群體遺傳學及藥物毒性安全評價。E-mail: 12414863@qq.com