腦膠質瘤組織β-連環蛋白、血管內皮生長因子的表達與微血管密度及其相關性研究

張驚宇， 張力娜， 舒永偉， 鄭永慧， 初婷婷， 趙　虹， 楊子超

哈爾濱醫科大學附屬第四醫院神經內科，哈爾濱　150081

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·論著·

腦膠質瘤組織β-連環蛋白、血管內皮生長因子的表達與微血管密度及其相關性研究

張驚宇， 張力娜， 舒永偉， 鄭永慧， 初婷婷， 趙虹*， 楊子超

哈爾濱醫科大學附屬第四醫院神經內科，哈爾濱150081

目的： 探討腦膠質瘤組織β-連環蛋白、血管內皮生長因子的表達與微血管密度以及三者的相關性。方法： 50例腦膠質瘤標本和40例健康對照標本，其中腦膠質瘤組包含低級別腦膠質瘤標本29例和高級別腦膠質瘤標本21例。采用免疫組織化學法檢測各組織標本中β-連環蛋白的表達；采用Western印跡法檢測血管內皮生長因子的表達水平；應用抗CD105抗體檢測新生血管內皮細胞表面標志蛋白CD105的表達水平，計算微血管密度。結果： 腦膠質瘤組β-連環蛋白表達陽性率、血管內皮生長因子表達水平和微血管密度均較對照組明顯升高(P<0.05)。與低級別腦膠質瘤組相比，高級別腦膠質瘤組的β-連環蛋白表達陽性率、血管內皮生長因子表達水平和微血管密度均明顯升高(P<0.05)。β-連環蛋白表達陽性率、血管內皮生長因子表達水平、微血管密度三者間均呈正相關性(P<0.01)。結論： 腦膠質瘤患者中β-連環蛋白表達陽性率、血管內皮生長因子表達水平及微血管密度均明顯升高，其中高級別腦膠質瘤中升高更明顯。

腦膠質瘤；β-連環蛋白；血管內皮生長因子；微血管密度

腦膠質瘤是臨床上備受關注的腦腫瘤之一，其發病率占顱內腫瘤的45.0%以上。大多數腦膠質瘤患者確診時，腫瘤已經高度異質性。腦膠質瘤相對其他腫瘤預后更差，致死率更高[1-2]。腦膠質瘤的侵襲和復發受多種基因、蛋白以及細胞因子等信號通路的共同調控[3]，但其發生機制目前仍未闡明。

β-連環蛋白的功能廣泛，其中最重要的功能之一是參與腫瘤細胞的增殖和遷移，因此目前成為人們研究惡性腫瘤發生機制的一個熱點[4]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)多由血管內皮細胞合成和分泌，是一類促進血管生成的關鍵因子，能刺激腫瘤新生血管的形成，并參與介導肝癌、肺癌、腎癌和顱內腫瘤等多種腫瘤的發生和發展過程[5]。因此，抑制腫瘤血管生成已成為治療顱內惡性腫瘤(如腦膠質瘤等)的新策略[6]。本研究通過檢測腦膠質瘤組織中β-連環蛋白、VEGF的表達水平和微血管密度，探討其與腦膠質瘤血管生成的相關性。

1　材料與方法

1.1標本50例腦膠質瘤標本及40例健康對照標本購自上海銳賽生物技術有限公司。根據WHO腦膠質瘤分類和分級標準[7]，50例腦膠質瘤標本中，Ⅰ級17例、Ⅱ級12例、Ⅲ級13例、Ⅳ級8例。Ⅰ級和Ⅱ級為低級別腦膠質瘤，共29例；Ⅲ級和Ⅳ級為高級別腦膠質瘤，共21例。

1.2免疫組織化學法檢測β-連環蛋白表達陽性率羊抗人β-連環蛋白單克隆抗體、S-P試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。標本經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，5 μm切片，然后應用免疫組織化學S-P法檢測β-連環蛋白的表達(具體操作按試劑盒說明書進行)。以試劑公司提供的陽性切片作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)作為陰性對照。光學顯微鏡下，細胞膜、細胞質和細胞核出現棕黃色、棕褐色顆粒或均質染色時，判定為β-連環蛋白陽性表達。400倍顯微鏡下觀察，每張切片觀察10個視野，每個視野計數100個腫瘤細胞，計算陽性細胞百分數，取平均值。結果判定：根據陽性細胞所占百分數進行分級，<5%為陰性(-)，5%～25%為弱陽性(+)，26%～50%為中度陽性()，>50%為強陽性()。1.3Western印跡法檢測VEGF表達水平裂解新鮮膠質瘤組織和正常腦組織后，提取總蛋白，用BCA法進行蛋白質定量。每例樣本各取15 μg蛋白，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，電泳結束后轉膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，再分別加入VEGF一抗(1∶500)和β-actin一抗(1∶200；兩種一抗均由美國Santa Cruz公司提供)，4℃反應過夜；PBS洗滌后，加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗VEGF一抗和抗β-actin一抗抗體(購自北京中杉金橋生物技術有限公司)；ECL法染色后，應用凝膠成像系統顯像。采用Image J軟件進行目的蛋白的定量分析。

1.4檢測腫瘤微血管密度以CD105蛋白作為血管內皮細胞的特異性標志物，用抗CD105抗體檢測新生血管內皮細胞表面的CD105表達水平。CD105蛋白染色可呈棕色或棕黃色，以10%細胞質呈棕黃色者判定為表達陽性。參照Eichten等[8]報道的方法計數微血管，將與相鄰微血管、腫瘤細胞或其他結締組織不相連的任何棕黃色區域作為一條獨立的微血管。先在100倍光學顯微鏡下全面觀察切片，確定腫瘤組織內血管密度最高的區域；再在200倍鏡下，將與周圍腫瘤細胞和結締組織明顯區別的棕黃色的內皮細胞或細胞叢作為一個血管，若不相連，分支結構即可作為一個血管。分別記錄5個視野內的微血管數，取平均數作為微血管密度值。

2　結　果

2.1腦膠質瘤組與健康對照組的β-連環蛋白表達陽性率、VEGF表達水平、微血管密度的比較腦膠質瘤組的β-連環蛋白表達陽性率、VEGF表達水平和微血管密度均較對照組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.2高級別腦膠質瘤組與低級別腦膠質瘤組的β-連環蛋白表達陽性率、VEGF表達水平、微血管密度比較高級別腦膠質瘤組的β-連環蛋白表達陽性率、VEGF表達水平和微血管密度均較低級別腦膠質瘤組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。2.3β-連環蛋白表達陽性率、VEGF表達水平、微血管密度的相關性研究β-連環蛋白表達陽性率與VEGF因子表達水平顯著正相關(rs=0.833,P<0.01)；β-連環蛋白表達陽性率與微血管密度呈顯著正相關(rs=0.786,P<0.01)；血管內皮生長因子表達水平和微血管密度呈顯著正相關(rs=0.770,P<0.01)。

表1　腦膠質瘤組與對照組β-連環蛋白表達陽性率、血管內皮生長因子表達水平、微血管密度比較

表2　高級別腦膠質瘤組與低級別腦膠質瘤組β-連環蛋白表達陽性率、血管內皮生長因子表達水平、微血管密度比較

3　討　論

腦膠質瘤源自神經上皮層，是中樞神經系統常見的預后較差的原發性腫瘤。腦膠質瘤的年發病率約為5/10萬，發病年齡高峰30～40歲[9]。腦膠質瘤的發生是一個涉及多基因的多步驟、多階段的復雜過程。

細胞內的許多信號轉導通路參與腦膠質瘤的發生和發展過程。細胞外分子信號結合細胞表面的特異性受體，并將信號轉導入細胞內，再通過細胞內各種信號轉導途徑的相互作用，將信號轉導入細胞核，最終活化相應的核內轉錄因子，調節相應轉導基因的表達，使該細胞完成轉分化[10]。多項研究表明，Wnt信號通路為重要的細胞信號轉導通路，參與調控細胞多種生命過程，如細胞分化、細胞增殖與凋亡、細胞免疫與應激，進而參與腫瘤的發生等[11]。在腦膠質瘤中，Wnt信號通路尤其是Wnt/β-連環蛋白信號通路與腫瘤的發生和發展密切相關[12]。

研究[13]表明，Wnt信號通路嚴重影響中樞神經系統的發育(尤其是胚胎階段)；Wnt信號通路還參與細胞的成熟(包括細胞增殖、分化，以及細胞的轉移和定位過程)。Wnt信號通路的特異性在于其發揮作用的時間僅局限于胚胎期，在嬰幼兒時期作用減弱，隨著機體的成熟，Wnt信號通路的作用逐漸消失。但在特殊的生理病理刺激信號作用下，Wnt信號被激活，其中以腦組織缺血的刺激作用最為明顯。β-連環蛋白是Wnt信號通路的關鍵蛋白。抑制β-連環蛋白的去磷酸化、抑制β-連環蛋白向核內轉移、在β-連環蛋白水平抑制Wnt信號通路的激活是目前人們廣泛關注的靶向治療方案。抑制Wnt信號通路是腦膠質瘤等腫瘤的基因治療策略之一。本研究結果顯示，腦膠質瘤組β-連環蛋白陽性表達率較對照組升高，高級別腦膠質瘤組的β-連環蛋白陽性表達率較低級別腦膠質瘤升高，說明β-連環蛋白表達增加與腦膠質瘤的發生和發展相關。

腫瘤血管生成是一個復雜的病理生理過程。充足的血供才能支持腫瘤細胞的生長、浸潤和轉移。VEGF是促進腫瘤血管生成的關鍵刺激因子，幾乎參與腫瘤血管生成的每個環節[14]。VEGF可以通過旁分泌等方式，加快血管內皮細胞的增殖，重構血管，促進新生血管的形成。VEGF可能通過促進原有血管網的擴張和過度生長，以及刺激血管內皮祖細胞的分化，從而促進新生血管形成。微血管密度可用來判定腫瘤血管的生成情況[15]。本研究發現，腦膠質瘤組的VEGF表達水平及微血管密度較對照組升高(P<0.05)，高級別腦膠質瘤組的VEGF表達水平及微血管密度較低級別腦膠質瘤顯著升高(P<0.05)，說明VEGF參與腫瘤血管的形成，進而使腫瘤細胞過度增殖。此外，本研究發現，β-連環蛋白表達陽性率、VEGF表達水平、微血管密度三者之間均呈正相關性，提示Wnt信號通路與腦膠質瘤的血管生成明顯相關。

綜上所述，本研究發現腦膠質瘤中β-連環蛋白表達、VEGF表達及微血管密度均顯著增加，在高級別腦膠質瘤中增加更明顯，提示β-連環蛋白表達陽性可反映腦膠質瘤的發生和發展。但本研究入組例數較少，且為單中心研究，故結論尚須多中心、大樣本的研究來進一步證實。

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[本文編輯]葉婷， 張藝鳴

The β-catenin and vascular endothelial growth factor expressions and microvessel density in glioma and their correlations

ZHANG Jing-yu, ZHANG Li-na, SHU Yong-wei, ZHENG Yong-hui, CHU Ting-ting, ZHAO Hong*, YANG Zi-chao

Department of Neurology, Fourth Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150081, Heilongjiang, China

Objective： To investigate the expressions of β-catenin, vascular endothelial growth factor (VEGF), and microvessel density in glioma and their correlations. Methods： 50 glioma specimens and 40 health control specimens were collected. The gliomas were divided into low grade gliomas (n=29) and high grade gliomas (n=21).The expression of β-catenin in all specimens was detected by immunohistochemistry . The level of VEGF was detected by Western blotting. The expression of CD105(a surface marker of neovascular endothelial cell) was examined by anti-CD105 antibody, and the microvessel density was calculated. Results： The positive expression rate of β-catenin, the level of VEGF and microvessel density in glioma group were significantly higher than that in control group (P<0.05). Compared with the low grade gliomas, the three indexes were obviously higher in high grade gliomas (P<0.05). There was a positive correlations between the positive expression rate of β-catenin, the level of VEGF, and microvessel density (P<0.05). Conclusions： The positive expression rate of β-catenin, the level of VEGF, and microvessel density in glioma patients increase obviously, and those are more significant in the patients with high-grade glioma.

glioma; β-catenin; vascular endothelial growth factor; microvessel density

2016-03-02[接受日期]2016-05-15

黑龍江省自然科學基金面上項目(H201423),哈爾濱市科技局青年后備人才項目(2013RFQYJ062).Supported by General Program of National Natural Science Foundation of Heilongjiang Province (H201423) and Youth Talent Program of Harbin Municipal Science and Technology Bureau (2013RFQYJ062).

張驚宇,博士,主任醫師. E-mail: zhangjingyuyx@163.com

Corresponding author). Tel: 0451-85939431, E-mail: zhaohong661214@163.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160198

R 739.41

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