高油酸油菜研究現狀、存在的問題及發展建議

張振乾，胡慶一，官春云

(湖南農業大學農學院，長沙 410128)

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高油酸油菜研究現狀、存在的問題及發展建議

張振乾，胡慶一，官春云*

(湖南農業大學農學院，長沙 410128)

高油酸菜油具有很好的營養保健功能，其品質可與茶油、橄欖油等高級食用植物油媲美，對于改變我國食用植物油自給不足、促進油菜產業升級等方面有很好的作用。總結了國內外相關研究機構在高油酸油菜方面的研究動態及應用情況，同時對油酸的遺傳特性、高油酸油菜選育途徑(小孢子培養、遠緣雜交、誘變和轉基因技術)和分子生物學研究進展進行了綜述，并針對當前存在的問題提出了一些建議。

油菜；高油酸；遺傳；育種

高油酸油菜是指種子中油酸含量大于75%的油菜品種。高油酸菜油具有以下優點：①降低超重人群的心血管疾病和血漿中的低密度脂蛋白膽固醇含量，有利于人體心血管健康，對心臟起保護作用。②高油酸油在高溫下不易氧化變質，保質期長，加熱到較高溫度時不冒煙，烹飪時間減少，損耗也較少，非常適用于家庭烹調及要求存放時間長的快餐食品類和糕點類；同時，其煎炸產品還擁有較好的香味。③用高油酸油生產的生物柴油穩定性強，點火溫度低，冬季操作性能好。

高油酸菜油是可與茶油、橄欖油媲美的高級食用植物油，且油菜種植簡單易行，可有效提高我國高級食用植物油的供給水平；同時依據優質優價原則，農民的種植積極性將大幅提高，可有效增加我國油菜種植面積，改變我國食用植物油嚴重依賴進口的局面。為了更好的發展高油酸油菜，促進油菜產業的可持續發展，本文綜述了高油酸油菜研究的最新進展，歸納了目前高油酸油菜研究的一些情況，并提出了一些建議和意見。

1　油菜高油酸研究現狀

1.1國外高油酸油菜發展情況

1992年，Auld等[1]利用EMS誘變獲得世界上第一個油菜高油酸突變體。1995年，第一個高油酸油菜品種(油酸含量81%)由Rücker和R?bbelen選育成功[2]。1992年，芬蘭開始白菜型油菜的高油酸育種研究[3]。2004年，歐洲第一個獲得注冊的HOLL油菜品種‘SPLENDOR’(油酸含量76.48%)問世[4]，隨之，V140OL、V141OL、V161OL(油酸含量均高于75%)等高油酸常規品種相繼推出，主要用于訂單農業生產[5]。2004年，加拿大Cargill種子公司CNR604(油酸含量75%)、CNR603(油酸含量85%)等品系參加品比試驗[6]。2006年，澳大利亞投放了兩個高油酸品種，2007年又推出替代品種[7]。這些品種的培育為高油酸品種進入初具規模的生產應用創造了條件。

1.2國內高油酸油菜發展情況

我國高油酸油菜研究從21世紀初開始，與國外相比雖然起步晚但發展速度快。湖南農業大學、華中農業大學及浙江省農科院等單位都開展了品種培育及分子機理方面的研究。2006年，湖南農業大學采用輻射誘變方法得到高油酸突變體[8]，通過多年的定向培養，2015年已經得到48個性狀穩定的高油酸品系，2個材料參加區試，10個材料參加品比試驗；并同步與湖南省春云農業科技股份有限公司及湖南盈成油脂工業有限公司聯合開展了訂單農業生產示范。此外，華中農業大學2012年在江陵縣馬家寨鄉建立高油酸油菜籽生產基地；浙江省農業科學院培育出油酸含量接近80%的新品系‘浙油20’，推出了“愛是福”高油酸健康菜籽油[9]；并使高油酸品種產量水平得到進一步提高，新育成的高油酸品系‘I10’產量和株型接近主栽品種‘浙雙72’，2010年轉讓給浙江農科糧油股份有限公司進行產業化開發[10]，并于2015年通過浙江省品種審定，成為我國第一個高油酸油菜新品種——‘浙油80’。安徽省農業科學院作物研究所2011年與大平集團和巨興大平油料合作社合作，由巨興大平油料合作社生產試種高油酸油菜。由于品種審定標準出臺較晚，審定通過的高油酸油菜新品種較少，我國迄今尚無在生產上大面積應用的高油酸油菜品種[9]。

2　高油酸油菜育種研究情況

2.1常規方法

一般常用定向選擇(從現有的高油酸材料中選擇油酸含量較高的材料。該方法周期長，且不能創造新品種和新的類型)或雜交轉育(含高油酸性狀的材料間進行雜交，并在其雜種后代中通過選擇而育成純合品種)的方法培育高油酸油菜，具體如表1。

表1　常規方法培育高油酸油菜的研究情況Table 1　The breeding situation of high oleic acid rapeseed by traditional methods

2.2高油酸油菜育種材料早期篩選

王敬喬等[17]發現，可通過將葉片置于含有次氯酸鈉和吐溫的混合溶液中，觀察葉片氧化變白的快慢，在早期階段區分具有高油酸性狀的FAD2基因突變體。高建芹等[18]研究發現，除花期外，各生育期營養器官與生殖器官中的油酸相對含量呈極顯著正相關，可通過檢測營養器官的油酸含量預測和篩選種子高油酸含量。

2.3誘變

誘變是當前高油酸油菜育種材料創新的主要方法，包括物理誘變和化學誘變。大多數高油酸突變都是由“A”插入或氨基酸替代引起的[19]。主要有兩個突變機制：一是控制油酸脫飽和生成亞油酸的Δ12-油酰脫飽和酶基因FAD2中發生了一個或多個核苷酸突變，產生了終止密碼子，導致翻譯過程中肽鏈的過早終止，使所翻譯的多肽不能作為有活性的脫飽和酶起作用，油酸因此不能脫飽和生成亞油酸而大量積累[8，20]；二是FAD2基因中的核苷酸突變引起所編碼的Δ12-油酰脫飽和酶FAD2中氨基酸的改變，影響蛋白質的折疊和空間結構，進而影響酶的活性或酶與底物結合的能力，最終導致高油酸突變體的產生[21～23]。

2.3.1化學誘變

化學誘變產生點突變的頻率較高，誘發染色體畸變相對較少且多為顯性突變體，對油料作物脂肪酸品質改良具有一定的特異性[24]。

化學誘變多采用甲基磺酸乙酯(EMS)。Auld等[1]利用EMS誘變，分別獲得了油酸含量88%以上的甘藍型油菜突變體X-82 M3、M4株系及亞油酸、亞麻酸含量大幅降低的白菜型油菜突變體M-30，將M-30與低芥酸親本Tobin雜交，F4株系油酸含量超過87%。Rücker和R?bbelen利用誘變方法培育出高油酸品種Expander(油酸含量達81%)[25]；通過誘變甘藍型冬油菜品種Wotan，使得油酸含量由60.3%提高到80.3%[26]。Spasibionek[27]用EMS處理甘藍型冬油菜種子，對脂肪酸組成發生顯著變化的M2代種子再次處理，篩選出2個油酸含量76%左右的突變體。湖南農業大學用1.5%的EMS處理甘藍型油菜品種湘油15號，從M2代篩選到一株油酸含量達71%的高油酸植株[20]，多代自交篩選后得到油酸含量80%以上的材料。黃永娟等[23]也利用EMS誘變得到高油酸油菜突變體。

此外，還有利用其它誘變劑獲得高油酸材料的報道。加拿大通過8 mM亞硝酸乙酯的二甲亞酸溶液處理油菜品種Regent Topas和Amdor，獲得油酸含量為78%的突變系[28]。和江明等[29]用秋水仙堿溶液處理經200 mg/kg EMS誘變的甘藍型油菜小孢子24 h，用NLN 13培養基進行小孢子培養，得到了一份油酸含量為80.3%的突變材料。

2.3.2物理誘變

物理誘變一般采用60Co照射。官春云等[8]用8萬～10萬倫琴60Coγ射線輻射湘油15號干種子，對輻射后代進行連續選擇。由于高油酸突變體FAD2基因中DNA分子中發生鳥嘌呤轉換為腺嘌呤，經過幾個世代才能完成，因此直到M5多數植株油酸含量在70%以上，最高油酸含量達93.5%。

此外，西南大學利用航天誘變方法也獲得了油酸含量為87.22%的甘藍型油菜突變體[30]。

2.4基因工程方法

在植物體內，Δ12-油酰脫飽和酶FAD2是油酸合成與積累的重要調控位點[31]。目前常用反義表達和RNA干擾(RNA interference，RNAi)等[32]方法對其進行調控，以獲得較高的油酸含量，尤其是RNA干擾技術，在擬南芥中證明了其作用后[33]，在油料作物脂肪酸組成改良方面獲得了突破性進展[34]，相關研究見表2。

表2　利用基因工程技術獲得高油酸材料的研究進展Table 2　The study advances of high oleic rapeseed materials obtained by gene engineering technology

(續表2)

方法實驗材料獲得結果文獻油菜子葉柄內獲得了轉基因植株[38]RNA干擾甘藍型油菜油酸含量達到89%[39]甘藍型油菜構建了甘藍型油菜FAD2基因的ihpRNA表達載體,獲得轉基因植株,19個單株種子油酸含量大于75%,有11個單株種子油酸含量大于80%[40～42]甘藍型油菜油酸含量83.9%的無篩選標記轉基因油菜新種質,且這種新種質未表現出高油酸突變體的一些不良農藝性狀[43]低芥酸轉基因株系和甘藍型油菜FAE1基因和FAD2基因的協同干涉,獲得了高油酸(油酸含量75%)、低芥酸和低多不飽和脂肪酸的轉基因材料[44]甘藍型油菜油菜試管苗的帶柄子葉為外植體,得到9株抗PPT苗[45]構建了甘藍型油菜FAD2、FAD3、FATB基因共干擾載體,轉入甘藍型油菜中雙9號,2株油酸含量在75%以上[46]構建了FAD2與FAE1基因雙干擾載體,獲得144株抗性再生植株[47]轉基因植株FFRP4-4油酸含量提高到85%,F1代種子油酸含量在80%以上,飽和脂肪酸10%,芥酸未檢出[48]

2.5分子標記輔助選擇

利用與控制油酸含量的基因緊密連鎖的分子標記對攜帶有高油酸基因的植株進行早期選擇[25]，可以減少大田選擇的工作量，增加育種的選擇反應和成本效益[49]。目前，已鑒定的油酸含量有RAPD(random amplified polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA)、SNP (single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態性)、SSR (Simple Sequence Repeats，簡單重復序列)和AFLP(amplified fragment length polymorphism，擴增片段長度多態性)等標記。

2.5.1RAPD標記

Tanhuanp??等[50]在白菜型春油菜中發現8個RAPD標記與油酸含量有關，其中最合適的標記是OPH-17，這些標記也位于LG6并與油酸位點相應的FAD2基因連鎖。Sharma等[51]利用芥菜型油菜重組自交系發掘出7個與油酸含量顯著相關的RAPD標記，其中3個標記在連鎖群LG9上連鎖，另外各有2個標記在連鎖群LG1和LG17上連鎖。將2個油酸含量QTL作圖在連鎖群LG9和LG1上，2個位點總共解釋32.2%的油酸含量變異，其中連鎖群LG9上的主要QTL解釋油酸含量變異的28.5%，定位于RAPD標記OPF 081000和OPI 101000之間。Javidfar等[52]在甘藍型油菜中鑒定出6個相互獨立的油酸含量RAPD標記，其中UBC2830可解釋43%的油酸含量遺傳變異。

2.5.2SNP標記

Hu等[21]發現甘藍型油菜FAD2突變基因中發生了單核苷酸變異，基于這一單核苷酸差異，開發了FAD2突變等位基因特異的SNP標記并在連鎖群N5上作圖，該圖可解釋76.3%的油酸含量變異。Tanhuanp??等[22，53]開發了一個白菜型春油菜油酸含量相關的SNP標記，發現野生型和高油酸的FAD2基因位點只有一個核酸序列差異，導致一個氨基酸改變。SNP標記對油酸含量選擇比SCAR標記更為有效[52]，而且，采用PCR產物直接染色而不是電泳的方法可使等位基因特異檢測進一步簡化。Falentin等[54]根據突變體和野生型等位基因的序列差異，開發兩個SNP標記，分別對應FAD2C基因和FAD2A基因的突變。Yang等[55]以SW Hickory(油酸含量大約為78%)×JA177(油酸含量64%)F1花蕾進行小孢子培養獲得DH群體。QTL定位表明，控制油酸含量的主效QTL位于甘藍型油菜的A5連鎖群上，可解釋89%的表型變異。

2.5.3SSR標記

王欣娜[56]以低油酸高亞麻酸10L421和高油酸低亞麻酸10L422親本雜交獲得的F2群體為材料，在A1、A5、Cl和C5連鎖群定位到油酸含量相關的標記，其中A5和A1連鎖群上的標記分別解釋18.6%和9.5%表型變異。劉列釗等[30]對航天誘變高油酸突變體材料系進行標記，發現A05和A01染色體上的FAD2位點發生雙隱性突變，兩位點對表型的遺傳變異貢獻率分別達到31.1%和29.4%，為主效位點。陳偉等[57]在SWHickory×JA177產生的SJDH群體的A5染色體上定位到1個控制油酸含量的主效QTL，可解釋油酸表型變異的85.3%；并利用該QTL兩側的SSR標記BRMS007和BRGMS630進行輔助育種，獲得了油酸含量高且遺傳背景基本恢復為JA177的改良單株。Zhao等[58]以德國冬油菜品種Sollux和中國高油材料構建DH群體作圖，發現7個油酸含量相關的QTL，解釋59%的遺傳變異。Smooker等[59]的研究表明，SSR標記比區間作圖法和多個QTL定位方法更有效。

湖南農業大學用高油酸油菜品系HOP和甘藍型油菜湘油15號為父母本，在A5和C5連鎖群上各檢測到1個油酸含量主效QTL，這2個QTL能解釋60%～70%油酸含量變異，其中位于A5連鎖群的QTL效應值較大，與FAD2基因緊密連鎖[60]；在N5連鎖群上標記分析發現1個控制油酸的QTL，處于CNU398與CN53之間，LOD值為4.83，貢獻率達到59.37%[61]；構建了導入A5、C5兩個油酸QTL及只分別導入一個油酸QTL的BC2F1株系，背景回復率達90%以上[62]。

2.5.4AFLP標記

Lionneton等[63]篩選到2個油酸含量QTL，位于連鎖群LG2上E4M1_4處的QTL解釋51.8%的油酸含量變異，位于連鎖群LG6上E1M2_6處的QTL解釋9.5%的油酸含量變異。Schierholt等[12]對來自7488×DH11.4Samoutai后代進行AFLP分子標記研究，篩選到3個引物組合(E32M61、E38M62、E35M62)，在親本系及群體種子之間各表現為一個多態性帶。將這3個AFLP標記(E32M61-141、E38M62-358、E35M62-256)用于F2群體作圖，發現它們與高油酸等位基因連鎖。最緊密連鎖的AFLP標記E32M61-141距高油酸位點3.7 cM，可用于對高油酸性狀分子選擇的標記。在Brassica基因組中fad2位點在A基因組第15個連鎖群上，在油菜LG15中的fad2位點是一個作用拷貝(圖1)。

2.5.5其它方法

此外還有利用TRAP(target region amplified polymorphism，利用靶位區域擴增多態性)[64]和RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性內切酶片段長度多態性)[65]等方法對油酸含量進行的標記。

圖1　利用HO突變體群體構建的遺傳連鎖圖(Schierholt A et al，2000)Fig.1　The genetic linkage map of HO mutation populations注：a)7488×DH 11.4 Samourai；b)19661×DH 11.4 Samourai；c)the corresponding LG15 of the mapping population DH 11.4 Samourai DH Mansholts Hamburger Raps of Uzunova et al.(1995) with integrated AFLP markers (Ecke et al.unpublished results)。

3　遺傳規律

油酸含量受硬脂酸和亞油酸含量影響。促進油酸減飽和基因有兩個：FAD2基因(存在內質網中)和FAD6基因(存在葉綠體中)[28](圖2)。油酸含量從60%到近90%不等的事實也說明高油酸性狀遺傳比較復雜。

圖2　脂肪酸生物合成示意圖Fig.2　The figure of fatty acid synthesis

近年來有大量高油酸遺傳特性方面的研究，如表3所示。

表3　高油酸遺傳特性研究Table 3　Study about the genetic characteristics of high oleic acid rapeseed

由表3可以看出，高油酸遺傳特性研究主要有3種觀點：多基因控制，多基因控制和受環境影響，單基因控制。多數研究認為油酸遺傳特性由多基因控制。遺傳結果不盡相同，可能與試驗材料的不同有關。

4　高油酸油菜研究

4.1產量與農藝性狀

Hitz等[35]發現，高油酸突變體IMC129(油酸含量77.8%)農藝性狀較好，但再次突變(油酸含量87%)后，植株農藝性狀較差，可能是由于該突變體葉片和根系等器官中的油酸含量相應提高，使其在較低溫度下種植時會出現明顯的生長發育障礙，也有可能是由于FAD2基因突變改變了葉片表面蠟的沉積結構并增大了葉片表層的溶液滲透性[17]。

浙江省農科院培育的“浙油80”生產試驗比對照減產3.7%，產油量比對照增加0.4%，差異不顯著。周銀珠[75]和黃永娟等[23]研究認為，高油酸性狀對油菜主要農藝產量性狀沒有明顯的不利影響。本實驗室的研究也發現，高油酸品系與普通油酸品系間產量差異未達到顯著水平[82，83]，且2014、2015年度的品比試驗結果也發現其產量與普通品種無明顯差異。

Guguin等[5]報道，HOLL雜交種產量比HOLL常規種高15%以上，最好的HOLL雜交種產量與當家雙低雜交種非常接近。油菜種子油酸含量與種子產量是否呈負相關，目前還不是很清楚，但現在鑒定的有些品系(組合)產量降低并不明顯[28]，可通過育種的努力來補償產量的降低[68]。Antje等[84]發現，高油酸冬油菜(油酸含量大于75%)產量與葉子和種子中的油酸含量呈負相關，油酸含量高會延遲種子發芽。

4.2油酸與含油量及其它脂肪酸含量之間的關系

M?llers等認為油酸含量和含油量呈正相關[68]，可提高0.6%的含油量[84]；Zhao等[58]也認為脂肪酸組分與含油量之間有密切關系。但Smooker等[59]及本實驗室的研究都認為，高油酸油菜的油酸含量與含油量并無線性關系。因此，油酸含量與含油量之間的關系仍需進一步研究。

油酸含量與其它脂肪酸含量間關系的研究較多，但目前尚無一致結論。Zhao等[58]認為油酸含量與芥酸、亞油酸含量和含油量負相關。閻星穎[76]發現油酸與其他脂肪酸呈極顯著負相關；尚國霞[80]發現硬脂酸與油酸含量呈正相關，棕櫚酸與油酸含量呈負相關，與亞油酸、亞麻酸呈極顯著負相關；Guy等[85]發現芥酸含量對油酸含量有顯著影響。

4.3環境及栽培因素對高油酸性狀的影響

油酸是由一些主效基因控制的遺傳性狀(99%)[59]，種子中的油酸含量在不同環境下均能穩定表達[86，87]，高油酸性狀表達是穩定的[72]，同時還受到環境及栽培因素影響。

4.3.1O3對油酸含量的影響

Karine等[88]研究了對流層O3升高對春油菜(甘藍型油菜品種)的影響，在一個開頂式氣室進行了3年試驗。在整個生長季節，每天有8 h，O3濃度比環境濃度增加20和40 ppb。結果顯示：O3濃度對春油菜種子質量特性有影響，其中油酸含量顯著降低。本實驗室研究也發現低溫處理會導致油酸減飽和反應的活性降低。

4.3.2栽培措施對油酸含量的影響

Baux等[89]發現，HOLL冬油菜品種產量低于常規品種，但與品比試驗預期值接近，農民采用適當的栽培管理措施對決定油菜最終品質起到關鍵性作用。

本實驗室發現，氮肥施用量與油酸含量負相關；在一定范圍內，施用磷肥、鉀肥有利于油菜油酸含量的提高，過量則降低油酸含量；硫肥施用量與油酸含量正相關[90]。

4.4生物學機制研究

4.4.1FAD2基因相關研究

FAD2基因是油酸合成的關鍵基因，提高油酸含量可通過降低油酸脫氫酶FAD2的活性來獲得[35]。FAD2基因是功能保守的基因，各物種之間的序列具有較高的相似性[73]。

梁會娟等[91，92]構建了油菜FAD2基因的RNAi植物表達載體。Yang等[55]在高油酸親本SW Hickory中BnaA.FAD2.a(LG A5)拷貝發現一個4 bp的插入，該突變造成開放閱讀框的移碼，最終導致提前終止密碼子，屬于一種新的高油酸等位基因。BnaA.FAD2.a基因在脂肪酸合成最為旺盛的種子發育中后期(14～25 d)表達量急劇上升，為營養生長時期的7～20倍。Suresha等[93]發現，FAD2基因表達量與早期的開花后15 d和晚期的開花后45 d種子發育階段相比，開花后30 d表達量上升。低溫處理下表達量提高1倍以上，而較高溫度處理上升3倍以上。本實驗室研究發現，油菜授粉后25～40 d為油酸形成期[94]；利用近等基因系材料授粉后25 d種子構建了SSH文庫，得到480個克隆，其中88個基因為油酸含量的上調基因，18個為下調基因，大部分基因與代謝和調控相關[95]；構建了授粉后25 d種子的均一化文庫，滴度為2.61×106cfu/mL，重組率100%，插入片段長度在800～2000 bp[96]；從甘藍型油菜中克隆了fad2基因一段2374 bp的上游序列，并用5-RACE技術確定了fad2基因的轉錄起始位點，通過啟動子分析以及順式作用元件分析，確定fad2基因的基本啟動子在-220～-1 bp區域，還發現fad2基因啟動子序列中含有一段1254 bp的內含子，該內含子序列中包含多個種子特異性表達特異性元件和植物激素響應元件，FAD2基因受脫落酸調控，在-538～-544 bp處的脫落酸響應元件使fad2基因在脫落酸的處理下提高了表達水平[97]；克隆了1個FAD2拷貝基因，定位到C1染色體上，命名為BnFAD2-C1，其開放閱讀框為1155 bp。采用RACE技術獲得了175 bp的5′ UTR序列和212 bp的3′ UTR序列。采用熒光定量PCR檢測發現，BnFAD2-C1在根、花和角果皮中僅保持本底水平的表達，在種子發育中期呈現高效表達，具有種子特異性誘導表達的特征，茉莉酸可能在BnFAD2-C1基因的表達過程中發揮一定的調控作用[98]。

此外，陳松等[99]發現，W-4的T2代單株的基因組含有一個T-DNA拷貝，T-DNA左邊界序列完全整合到油菜基因組中，僅有1個堿基由G轉換成了A，而右邊界則缺失了包括RB border在內的62個堿基。陳松等[100]還比較了轉基因高油酸油菜品系W-4的T5、T6和T7種子以及非轉基因對照Westar種子中的脂肪酸組成，結果表明油菜種子中FAD2基因下調表達對種子的脂肪酸合成與積累影響較大，其不僅顯著降低種子中多不飽和脂肪酸含量，增加油酸的含量；而且也顯著降低飽和脂肪酸含量，并促進長鏈單烯酸的合成。

4.4.2FAD2基因拷貝數的研究

FAD2基因以多拷貝形式存在，不同拷貝之間在堿基序列和氨基酸序列上存在一定差異[66]。多拷貝現象對分子育種有不利影響，如在轉基因植物中，插入外源基因的拷貝數過多，則會導致表達不穩定甚至轉基因沉默現象[101，102]。相關研究如表4所示。

表4　油菜FAD2基因拷貝數的研究Table 4　Study about the number of fad2 gene copies of rapeseed

由表4可知，目前多認為油菜FAD2基因為多拷貝，但具體的拷貝數仍需進一步研究。

4.4.3基因芯片方面研究

本實驗室采用基因芯片技術檢測到差異表達基因562個，上調表達基因194個，下調表達基因368個，以基因芯片中油菜上調基因NM_100489和下調基因NM_130183為材料，用實時熒光定量方法驗證基因芯片的結果，二者完全相符。丙酮酸激酶、果糖二磷酸、酰基傳遞/酰基ACP硫脂酶、作用于酯鍵的水解酶、Δ9硬脂酰-乙酰載體蛋白去飽和酶(ADS1)、Δ9酰基-油脂減飽和酶2(ADS2)、ω-3脂肪酸減飽和酶(FAD3)等被鑒定為差異表達基因。硬脂酸(18∶0)減飽和形成油酸的FAD1基因在表達時明顯上調，可能在油酸合成中也發揮重要作用[106]。采用超表達方法研究發現，SAD(FAD1)和FAD3基因對油酸形成積累確有一定影響。

4.4.4蛋白質組學方面研究

本實驗室還以湘油15號品種(對照)和高油酸油菜7 d幼苗為材料提取蛋白質，進行雙向電泳分析，共發現277個差異點，126個點的差異在2～4倍之間，對其中50個點進行MALDI-TOF/TOF 4800串聯質譜分析，42個差異點鑒定成功，分別為磷酸核酮糖羧化酶(23個)及其前體蛋白(4個)、黑芥子酶(2個)、ATP合酶亞基蛋白(4個)、葉綠體a/b結合蛋白(2個)及其它蛋白(7個)，并對差異蛋白對應的基因(15個)進行熒光定量PCR驗證，有4個基因的表達量在高油酸油菜幼苗中增加，3個降低[107]；以一組高油酸油菜近等基因系自交授粉后20～35 d的種子為材料，分別進行了轉錄組和同位素相對標記與絕對定量技術分析，結合前人研究發現，基因表達或蛋白表達發生顯著變化的基因gi|260505503(多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白)、gi|226346102(HSR203J類蛋白)和gi|470103214(鈣調蛋白類)與抗病相關；而gi|297843222(結合蛋白)、gi|18397961(2-鐵，2-硫-鐵氧化還原類蛋白)、gi|196052306(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞基)、gi|18423437(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶(輔酶)1α-復形5)和gi|297794581(激酶家族蛋白)等基因為差異顯著[108]。

5　高油酸油菜研究中的主要問題

5.1高油酸油菜育種研究進展緩慢

國內外雙低油菜從育成到實現雙低化均為10多年時間，而自1995年世界上第一個高油酸品種[11]問世至今，國外有報道的品種不足10個，國內目前也僅有一個新品種，進展較為緩慢。主要原因：①品種適應性、增產潛力還在進一步研究。②企業新產品的推出和廣大市民對高油酸菜油認識的提高還需一定時間。③宣傳不夠。今后應從發展高油酸油菜有利于保障我國食用油安全，提高國民健康水平和企業產品提質等方面進行宣傳。

5.2高油酸遺傳改良途徑有待進一步拓寬

目前培育高油酸油菜主要采用化學誘變方法，但也有研究表明，輻射[8]或太空誘變[30]方法也可得到性狀穩定的高油酸油菜材料，這為誘變育種提供了新的思路。分子標記育種方法有RAPD標記、SNP標記、SSR標記和AFLP標記等。SNP標記被稱為第三代DNA分子標記技術，有望成為最重要、最有效的分子標記技術，在分子育種中廣泛應用。

5.3油菜高油酸生物學機理研究需進一步加強

目前多數研究認為，油菜高油酸性狀遺傳主要受基因型影響，為多個基因控制，甘藍型油菜控制油酸性狀的主效基因位于A5連鎖群。但劉列釗等[30]在A5、C5連鎖群上都發現了主效基因，可能是由于育種材料不同引起的。因此在今后的研究中也要綜合考慮不同的材料。此外，高油酸遺傳性狀還受環境和栽培措施影響等方面的研究都還需進一步加強。

此外，油酸合成的關鍵基因的研究多集中在FAD2基因。FAD2基因為多拷貝，有一些拷貝是無功能的假基因，但具體拷貝數的多少及各個拷貝的功能仍需要進一步研究。

油脂的積累和脂肪酸的合成是一個龐大的網絡，FAD2基因表達機理與很多因素有關，所以在繼續探索FAD2基因的調控表達作用機理的同時，還要進一步研究十六碳烯酸、二十碳烯酸含量及芥酸含量對油酸含量積累的影響作用。

6　建議

(1)加快品種培育進程。要綜合利用各種育種方法及分子標記技術，同時結合一些早期鑒定的方法輔助育種，加快育種進程。

(2)弄清油酸合成的分子機理。深入研究FAD2基因對油酸合成的調控作用，包括其拷貝數及每個拷貝的功能等；同時搞清其它脂肪酸合成對油酸的影響。

(3)利用各種新技術進行新基因發掘。充分利用即將完成的油菜基因組測序結果，采用基因組學和蛋白質組學新技術，研究基因表達譜變化情況，結合生物信息學分析，發掘出FAD2以外影響油酸合成的新基因。

(4)加快推廣開發進程。種子管理部門要高度重視高油酸油菜發展，充分認識到高油酸油菜是油菜產業繼雙低油菜后的又一次新機遇；加大對高油酸油菜材料在區試等方面的支持力度，加快新品種的培育和審定及后續推廣。

(5)堅持優質優價原則，提高農民種植積極性。在生產實踐中，依照優質優價原則，適當提高高油酸油菜籽的收購價格，增加農民種植效益，提高其生產積極性，迅速擴大高油酸油菜種植面積，促進油菜產業進一步發展，提高我國食用油自給水平。

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Present Research Situation，Questions and Developmental Advises of High Oleic Acid Rapeseed

ZHANG Zhenqian，HU Qingyi，GUAN Chunyun*

(College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China)

High oleic acid rapeseed oil has very good nutrition and health functions，and its quality can be comparable with the camellia oil，olive oil and other senior edible vegetable oil，which is helpful to increase the edible vegetable oil supply of China and promote the upgrading of the rape industry.The study trend and application situation of Hunan Agricultural University and the other domestic and foreign research institutions were summarized in this paper.At the same time，the genetic characteristics of oleic acid，high oleic acid rapeseed breeding (microspore culture，distant hybridization，induced and transgenic technology)，advances of high oleic acid rapeseed breeding by different methods (such as，microspore culture，distant hybridization，mutation and transgenic technology)，and the molecular biology research were summarized.In addition，several advices were proposed according to the currently existing questions.

rapeseed；high oleic acid；genetic；breeding

2016-01-20

張振乾(1977-)，男，博士，副教授，Email：zzq770204@163.com。*通信作者：官春云，教授，博士生導師，從事油菜育種、栽培研究。

國家自然科學基金(31201240)；國家863計劃項目(2012AA101107-3)；湖南省科技重大專項(2014FJ1006)；湖南農業大學作物學開放基金(ZWKF201502)。

S565.403.2

A

1001-5280(2016)04-0462-13

10.16848/j.cnki.issn.1001-5280.2016.04.27