尿RBP膠乳增強免疫比濁檢測方法的建立及性能評價

俞俊文,劉獻文

(1.新疆維吾爾自治區葉城縣人民醫院，新疆喀什 844900 2.寧波美康生物科技股份有限公司，浙江寧波 315105)

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·臨床研究·

尿RBP膠乳增強免疫比濁檢測方法的建立及性能評價

俞俊文1,劉獻文2

(1.新疆維吾爾自治區葉城縣人民醫院，新疆喀什 844900 2.寧波美康生物科技股份有限公司，浙江寧波 315105)

目的根據膠乳增強免疫比濁原理，建立一種尿視黃醇結合蛋白(RBP)檢測方法。方法將RBP多克隆抗體標記到膠乳微球表面，利用抗原抗體凝集反應原理，建立了尿RBP免疫檢測方法，并對本方法進行了精密度、準確度、線性、穩定性試驗和相關性試驗。結果本檢測方法的靈敏度為0.2 mg/L，對濃度為1.07 mg/L的低值質控品重復測定20次，其精密度為2.28%；線性范圍為0.5～10.0 mg/L，對高、低濃度質控品的相對偏差為-6.03%和-2.95%，與RBP酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒的決定系數R2為0.998 6。結論該研究建立了尿RBP膠乳增強免疫比濁檢測方法，各項性能指標均達到臨床檢測要求，可用于臨床尿RBP濃度的檢測。

尿視黃醇結合蛋白；膠乳增強免疫比濁法；精密度；準確度

視黃醇結合蛋白(RBP)是由肝臟合成，自由通過腎小球，由腎小管近曲端上皮細胞重吸收并降解[1-2]。尿RBP濃度升高，提示腎小管近曲端重吸收功能障礙。尿RBP濃度與腎小管間質損壞程度呈明顯正相關，可作為檢測腎小管的病變病程，指導治療和判斷預后的一項靈敏的生化指標[3-4]。目前國內RBP檢測方法主要有酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和免疫比濁法，其中ELISA操作復雜，不能實現自動化檢測；而免疫比濁法的靈敏度低。本研究利用膠乳增強免疫比濁原理，建立了一種尿RBP檢測方法，現報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料收集2014年11月1～30日葉城縣人民醫院腎病患者尿標本45例，其中男20例，年齡25～50歲；女25例，年齡30～55周歲。

1.2儀器與試劑RBP多克隆抗體、RBP質控品、膠乳微球均為寧波美康生物科技股份有限公司提供。采用RBP ELISA檢測試劑盒(上海西塘生物科技有限公司)，7180型全自動生化分析儀(日本日立公司)進行檢測。

1.3方法

1.3.1膠乳微球的活化用50 mmol/L pH6.0的MES緩沖液稀釋膠乳,稀釋至乳膠微球體積分數為2%，取100 mL，加入碳二亞胺(EDAC)100 mg，室溫反應1 h，離心6 000 r/min 15 min，去上清液，沉淀懸浮于50 mmol/L pH6.0的MES緩沖液中，超聲分散；再次離心，去上清液，沉淀懸浮于50 mmol/L pH6.0的MES緩沖液中，超聲分散。

1.3.2膠乳微球的致敏邊攪拌邊加入10 mg RBP抗體，室溫反應1 h。6 000 r/min離心15 min，去上清液，沉淀懸浮于50 mmol/L pH6.0的MES緩沖液中，體積分數為1%，超聲分散，加入2%牛血清白蛋白(BSA)，4 ℃封閉過夜。離心去上清液，用分散液(50 mmol/L pH7.5的三羥甲基氨基甲烷+1% BSA+0.1%疊氮化鈉)溶解膠乳，體積分數為0.2%，超聲分散。

1.3.3性能評價測定儀器采用日立7180全自動生化分析儀，分析方法為兩點終點法。分析參數R1為240 μL，R2為60 μL，標本為10 μL；波長為546 nm。測定步驟：先加入R1和標本，于37 ℃孵育5 min后，加入R2，立即讀取第一點吸光度值，計時反應5 min后，讀取第二點吸光度值，計算兩點吸光度差值。定標曲線制作：以定標液濃度為橫坐標，各濃度定標液對應的吸光度差值為縱坐標，做logit-log(4p)函數曲線。標本濃度計算方法：根據標本的吸光度值差值，代入定標曲線，計算相對應的濃度值。

2　結　　果

表1　　靈敏度分析

2.2精密度測試將高、低濃度質控品各重復測定20次，計算精密度。本檢測方法精密度為≤10%。采用膠乳增強免疫比濁檢測法檢測質控品在高(4.51 mg/L)、低(1.07 mg/L)兩種濃度下的測量值，各重復測定20次，計算精密度。本檢測方法精密度為≤10%。結果顯示，在高、低兩種濃度下的精密度分別為1.57%、2.28%。

2.3準確度測試重復測定高、低濃度的兩份質控品，各重復測定3次，計算相對偏差。本檢測方法檢測質控品的相對偏差≤10%，說明方法具有很好的準確度。見表2。

表2　　準確度分析

2.4線性范圍測試將RBP為10 mg/L的高濃度尿標本用生理鹽水按照1.00、0.95、0.90、0.80、0.70、0.60、0.50、0.40、0.30、0.20、0.10、0.05的稀釋比例進行稀釋，每個濃度重復測定3次。以稀釋比例為橫坐標，以測定值為縱坐標作圖，進行線性相關性分析。本檢測方法對尿標本RBP的檢測范圍為0.5～10.0 mg/L。見圖1。

圖1　　檢測試劑線性分析

2.5抗干擾性在同一份人血清標本中分別加入不同濃度的干擾物質后進行測定。加入干擾物質后的測定值與加入干擾物質前的測定值之間的差值除以加入干擾物前的測定值比值即為干擾率。分別加入以下5種干擾物質，其結果為：(1)結合膽紅素添加量為0.0、37.5、75.0、100.0、150.0 mg/dL，干擾率分別為0.0%、0.0%、-1.0%、1.0%、-0.2%；(2)血紅蛋白添加量為0.0、125.0、250.0、375.0、500.0 mg/L，干擾率分別為0.0%、0.7%、-0.4%、-1.1%、-2.1%；(3)維生素C(VC)添加量為0.0、7.5、15.0、22.5、30.0 mg/L，干擾率分別為0.0%、-1.4%、-0.3%、-2.0%、-2.4%；(4)葡萄糖添加量為0.0、250.0、500.0、750.0、1 000.0 mg/L，干擾率分別為0.0%、0.2%、0.5%、1.0%、1.4%；(5)尿微量白蛋白(mAlb)添加量為0.0、25.0、50.0、75.0、100.0 mg/L，干擾率分別為0.0%、0.0%、0.0%、0.0%、0.0%。試驗結果表明結合膽紅素、血紅蛋白、VC、葡萄糖和mAlb的濃度分別在150.0、500.0、30.0、1 000.0、100.0 mg/dL時，它們對測定結果的干擾率均在3%以下。

2.6相關性分析采用本檢測方法和RBP ELISA檢測試劑盒，分別對45份人尿液進行測定，本檢測方法和對照試劑的決定系數R2為0.998 6，建立回歸方程Y=1.008 7X-0.029 8。該結果表明檢測方法與對照試劑具有很好的相關性。見圖2。

圖2　　兩種方法檢測值的回歸直線

3　討　　論

隨著社會環境和自然環境的日益變化，以及人口結構的老齡化，高血壓、糖尿病、冠心病、惡性腫瘤等慢性疾病已經成為危害國人健康的主要疾病。這些慢性疾病最容易累積腎臟，引起腎臟的病變。由于當前國內基層醫療機構的資源配備不足，導致慢性基礎疾病的控制不佳或者不斷進展，腎臟也在不知不覺中發生損傷，然而其強大的代償能力使得腎臟的慢性損傷缺乏明顯的臨床癥狀。由于臨床表現隱匿，往往不易早期發現，也失去了最好的干預治療時機。因此早期的腎臟診斷指標就顯得尤為重要。

目前，評價腎小管損傷的內源性指標主要有N-乙酰-B-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、β2-微球蛋白(β2-MG)等[5-6]。以上標志性蛋白均受諸多因素影響，限制了其臨床應用價值。NAG主要分布于近段小管上皮細胞中，尿NAG主要由腎小管上皮細胞破損，溶酶體破裂后釋放所致。腎小管輕微受損時，腎小管上皮細胞受損但沒有大量溶酶體破裂，從而使尿中NAG濃度較低，不能準確地反映腎小管間質損害程度[7]。β2-MG是有體內有核細胞產生，其血中濃度易受慢性炎癥、肝病、腫瘤、病毒感染等影響而升高，腎小管重吸收β2-MG的閾值為5 mg/L，當非腎性疾病導致β2-MG合成顯著增多時，血中濃度超過閾值，可出現腎小管非重吸收功能受損的β2-MG尿，血清和尿中均可增高，影響了其特異性；而且β2-MG在酸性尿中極不穩定，影響了其檢測準確度[8-9]。

而RBP是肝臟合成并分泌的一種低分子量蛋白，游離的RBP能迅速被腎小球濾過，幾乎全部被腎近曲小管重吸收而分解，尿液中RBP含量甚微。正常情況下，RBP在尿液中性能穩定，不易分解，不受尿pH值和血壓的影響，當腎近曲小管損傷時，其尿液中含量明顯增加。尤其當慢性腎病患者近端腎小管有損傷時，血β2-MG以及內生肌酐清除率尚在正常范圍內，RBP排泄量便有明顯增加。因此RBP是較為理想的反映腎小管間質受損的敏感特異性標志物，對診斷腎小管間質受損及受損程度、監控治療效果具有重要的應用價值和臨床意義[10-13]。

綜上所述，本研究采用膠乳增強免疫比濁原理建立了尿RBP檢測方法，具有良好的靈敏度、精密度、線性、準確度和相關性。并且在全自動生化儀上進行尿RBP檢測操作簡便、價格低廉、適合常規檢測，與其他指標聯合檢測能為腎臟損傷的部位和程度提供更準確的診斷依據，值得臨床推廣應用。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.054

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1673-4130(2016)17-2481-03

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