馬氏珠母貝msi60基因表達量與經濟性狀的相關分析

戰 欣， 于呈呈， 石耀華， 顧志峰，王愛民

(海南大學海洋學院，熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南省熱帶水生生物技術重點實驗室，海南?？?570228)

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馬氏珠母貝msi60基因表達量與經濟性狀的相關分析

戰 欣， 于呈呈， 石耀華， 顧志峰，王愛民*

(海南大學海洋學院，熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南省熱帶水生生物技術重點實驗室，海南?？?570228)

[目的] 探討礦化基因、貝殼和珍珠經濟性狀之間的相關關系。[方法] 選擇47個培育優質珍珠的馬氏珠母貝，測量貝殼的殼寬、殼高、殼長、絞合線長、總殼重、左殼重、珠層厚度及珍珠的直徑、重量、珠層厚度，并分析礦化基因msi60在外套膜內緣組織的相對表達量，珍珠經濟性狀和貝殼經濟性狀之間的相關關系。[結果] 珍珠的珠層厚度、珍珠直徑和珍珠重量3個經濟性狀均與受體貝貝殼的殼寬、殼長、總殼重和左殼重呈顯著相關，推測育珠貝的生長狀況在一定程度上影響珍珠的培育；msi60在外套膜內緣的相對表達量與珍珠重量之間存在相關性(P= 0.059)，貝殼和珍珠的珍珠層厚度存在顯著相關性(P= 0.019)，推測在馬氏珠母貝中，貝殼的礦化和珍珠的礦化可能具有共同的上游調控元件。[結論]msi60在形成貝殼珍珠質層的外套膜內緣組織中的基因表達量與珍珠的經濟性狀相關。該研究為馬氏珠母貝生物礦化分子機制的研究提供基礎資料。

貝殼；珍珠；經濟性狀；殼基質蛋白；馬氏珠母貝

馬氏珠母貝(Pinctadafucatamartensii)是培育海水珍珠的主要珍珠母貝，其貝殼具有珍珠質層，可用于制作貝雕、珍珠粉，亦可作為珍珠的代用品供藥用和化妝品的制造[1]。目前，我國海水珍珠產業已成為廣東、廣西和海南部分地區重要的支柱性產業[2]，因此，對于馬氏珠母貝的遺傳育種和海水珍珠礦化過程的研究一直是熱點問題。

馬氏珠母貝的貝殼由珍珠層和棱柱層組成，珍珠質層是由外套膜內緣的上皮細胞分泌的[3-5]，貝殼和珍珠的珍珠層組成成分完全相同。貝類貝殼的絕大部分由CaCO3晶體構成，僅不到5%的組成成分是有機基質，包括蛋白質和多糖。蛋白質是由貝類的外套膜組織分泌的，負責調控貝殼的形成[6]，mis60是參與貝殼珍珠質層形成的蛋白之一，不溶于水，在形成貝殼珍珠質層的外套膜內緣組織中表達[3,5]。

馬氏珠母貝的研究主要包括遺傳育種[7-8]、插核育珠[9-11]、珍珠形成的分子機制研究[12-14],但很少將育珠貝的生長性狀、珍珠的經濟性狀和礦化基因表達量進行綜合分析，探討育珠貝對珍珠形成的影響。筆者分析了msi60基因在馬氏珠母貝外套膜內緣組織的基因表達量，貝殼經濟性狀和珍珠經濟性狀之間的相關性，旨在為貝類生物礦化分子機制的研究提供基礎資料。

1　材料與方法

1.1樣品和數據收集馬氏珠母貝于2012年11月采自海南省陵水市馬氏珠母貝養殖場，從506個育珠貝中選取培育優質珍珠的馬氏珠母貝47個，將其外套膜內緣組織放入RNAstore樣本保存液(天根生化科技有限公司，北京)中保存，后立即放入-80 ℃冰箱中存放。測量47個馬氏珠母貝貝殼的殼寬、殼高、殼長、絞合線長、總殼重、左殼重、珠層厚度以及所產珍珠的直徑、重量和珍珠質層厚度。貝殼和珍珠的珍珠層厚度采用光學相干斷層掃描儀OSLF-1500(斯爾頓科技有限公司，深圳)測量。

1.2RNA提取和cDNA合成外套膜內緣組織的RNA提取采用TRNzolA+總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)，操作步驟按說明書進行。cDNA合成采用Quant cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)，合成的cDNA稀釋6倍后保存于-20 ℃用于熒光定量PCR擴增。

1.3熒光定量PCR擴增參考基因使用β-actin，其正向引物序列actin-F為GGTCACTCACACCGTGCCTAT，反向引物序列actin-R為GTGATGTCTCTTCCGGCTAGGT[15]。mis60基因熒光定量PCR的正向引物msi60-F為AGGTGGACGAAGAGGTAGAGGTAG，反向引物msi60-R為AGCGGCAGCGGCAACATC[16]。熒光定量PCR擴增使用SuperReal PreMix (SYBR Green) (天根生化科技有限公司，北京)。熒光定量PCR反應體系：1 μL cDNA,10 μL 2×SuperReal PreMix (添加SYBR Green染料),0.4 μmol/L 的正反向引物，PCR總體積為20 μL。熒光定量PCR程序：95 ℃變性15 min；95 ℃變性15 s，60 ℃ 運行 30 s，共40個循環。每個樣品的熒光定量PCR反應重復3次，取平均值作為基因表達量的最終結果。采用溶解曲線法(60～95 ℃)檢測是否存在非特異性擴增。

1.4數據分析計算貝殼和珍珠各個經濟性狀的平均值、標準差、最大值和最小值；基因表達量的結果分析采用ΔΔCT法[17]； 采用SPSS 15.0軟件(SPSS,Chicago,USA)估算msi60在外套膜內緣組織的基因表達量與珍珠和貝殼經濟性狀之間的相關性。

2　結果與分析

2.1貝殼和珍珠的經濟性狀47個馬氏珠母貝的貝殼和珍珠經濟性狀的平均值、標準差、最小值和最大值見表1。由表1可知，珍珠的珠層厚度(0.32 mm)比貝殼的珠層厚度(0.94 mm)薄；msi60在外套膜內緣組織的相對表達量在不同馬氏珠母貝個體中的差異較大(標準差 = 4.22)。

表1　珍珠和貝殼的經濟性狀

2.2相關性分析msi60在外套膜內緣組織的基因表達量與珍珠、貝殼經濟性狀之間的相關性分析結果見表2。由表2可知，珍珠的珠層厚度、珍珠直徑和珍珠重量3個經濟性狀均與育珠貝貝殼的殼寬、殼長、總殼重和左殼重具有顯著相關性。雖然表1中貝殼的珍珠質層厚度比珍珠厚，但從表2可以看出，貝殼和珍珠的珠層厚度存在顯著相關性(P=0.019)。msi60在外套膜內緣組織的相對表達量與珍珠重量存在相關性(P= 0.059)。

表2　msi60在外套膜內緣組織的基因表達量與珍珠和貝殼經濟性狀之間的相關性

3　討論

3.1貝殼與珍珠經濟性狀之間的相關性分析影響貝殼和海水珍珠價值的品質除色澤、大小等性狀外，還有一個比較特殊的性狀即珠層厚度[18]，在養殖珍珠分級國家標準中明確規定了海水養殖珍珠珠層厚度的分級標準(GB/T 18781—2008)。珠層厚度越厚，珍珠的經濟價值越高，但珍珠生長在珍珠囊中，在不傷害育珠貝的前提下，很難檢測到珍珠的珠層厚度。該研究發現，珍珠的珠層厚度與貝殼的殼寬和殼長等性狀呈顯著相關性，這為根據殼寬和殼長等性狀推測珍珠的珠層厚度提供了可能。

Wada等[19]研究發現，育珠貝的貝殼重量與所產珍珠的重量呈正相關性，該研究也得到類似的結果。珍珠的珠層厚度、珍珠直徑和珍珠重量3個珍珠的經濟性狀均與育珠貝貝殼的殼寬、殼長、總殼重和左殼重具有顯著相關性，說明馬氏珠母貝育珠貝的生長速度越快，個體越大，貝殼越隆起，培育大型珍珠的可能性越高，推測育珠貝的生長狀況在一定程度上影響珍珠的培育，在實踐中可以將貝殼的殼寬、殼長等經濟性狀作為育珠貝選擇育種的重要指標。

3.2msi60相對表達量與經濟性狀之間的相關性該研究發現，貝殼和珍珠的珍珠層厚度存在顯著相關性(P=0.019)，雖然珍珠和貝殼具有相同組成成分的珍珠質層，但貝殼的礦化過程對于育珠貝而言是一個必需的生長過程，而珍珠的形成對于育珠貝而言是一個排斥異物的免疫過程[18]，由于形成珍珠的珍珠囊是來源于小片貝的組織，其遺傳物質與育珠貝不同，msi60基因在珍珠囊的表達和在外套膜內緣的表達并不完全相同。另外，生物礦化受多基因調控且易受環境因素的影響，因此，該研究僅發現msi60在外套膜內緣的相對表達量與珍珠重量(P= 0.059)存在相關性。

該研究通過探討馬氏珠母貝珍珠、貝殼經濟性狀和msi60在外套膜內緣組織基因表達量之間的相關性，初步探討了生物礦化過程在珍珠形成和貝殼的珍珠質層形成過程中的異同，為闡明生物礦化分子機制研究提供資料。

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Relationship between Gene Expression ofmsi60 and Economic Traits inPinctadafucatamartensii

ZHAN Xin,YU Cheng-cheng,SHI Yao-hua, WANG Ai-min*et al

(Marine Institute,Hainan University,Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education,Hainan Key Laboratory of Tropical Hydrobiological Technology,Haikou,Hainan 570228)

[Objective] The aim was to analyze the correlations among gene expression levels ofmsi60,economic trait of shell and economic trait of pearl oyster.[Method] A total of 47 pearl oysters that cultured high quality pearls were selected and ten traits (shell width,shell height,shell length,hinge length,total shell weight,left shell weight,thickness of shell nacreous layer,pearl diameter,pearl weight and thickness of pearl nacreous layer) of the selected samples were measured.The correlations among gene expression levels ofmsi60,economic traits of shell and economic traits of pearl were analyzed.[Result] All of the economic traits of pearls were significantly correlated with shell width,shell length,total shell weight and left shell weight.It was assumed that the growth status of host oyster affects pearl culture.It was found that gene expression levels ofmsi60 in mantle center were correlated with pearl weight(P=0.059).What’s more,thickness of shell and pearl nacreous layer were significantly correlated with each other(P=0.019).[Conclusion] Gene expression ofmsi60 is correlated with economic traits of pearl.The study will enrich the information for elucidating the molecular mechanism of biomineralization.

Shell; Pearl; Economic trait; Shell matrix protein;Pinctadafucatamartensii

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(2010CB126405);海南大學科研啟動基金項目(kyqd1216);海南大學青年基金項目(qnjj1227);海南省青年基金項目(313033)。

戰欣(1981- )，女，遼寧大連人，講師，博士，從事貝類育種和分子生物學研究。*通訊作者，教授，博士，博士生導師，從事貝類遺傳育種研究。

2016-06-27

S 968.3

A

0517-6611(2016)23-084-03