異養硝化-好氧反硝化菌Bacillus sp.JB4的分離鑒定試驗

李泳洪，陳小嵐，許旭萍

(福建師范大學 生命科學學院，福建 福州 350108)

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異養硝化-好氧反硝化菌Bacillus sp.JB4的分離鑒定試驗

李泳洪，陳小嵐，許旭萍

(福建師范大學 生命科學學院，福建 福州 350108)

采用異養硝化培養基與BTB培養基分離篩選到了一株異養硝化-好氧反硝化菌JB4，通過形態觀察、生理生化鑒定及16SrDNA序列測定，初步鑒定JB4為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)。試驗結果表明：該菌株JB4具有良好的異養硝化-好氧反硝化能力，12h內氨氮去除率為76.95%～84.58%，亞硝態氮的積累量小于1.83 mg/L。

異養硝化；芽孢桿菌；脫氮

1　引言

筆者篩選到一株具備高效脫氮能力的異養硝化-好氧反硝化菌株，在此基礎上，對其進行菌種鑒定、異養硝化性能的測定等，為進一步研究該菌株的脫氮路徑、脫氮產物及其應用于實際廢水的處理提供理論基礎。

2　材料與方法

2.1材料

2.1.1樣品

試驗樣品采自福州市閩侯縣某排污口淤泥、閩江口某池塘廢水及淤泥、建甌福矛酒廠酒曲和堆積樣等。

2.1.2培養基

(1)BTB培養基[5,6](g/L)：丁二酸鈉 4.72，NaNO30.85，KH2PO41.00;FeSO4·7H2O 0.20;MgSO4·7H2O 0.10，溴百里酚藍1 mL，瓊脂15(固體培養基加入)，pH值=7.0～7.3。

(2)異養硝化培養基(HNM)(g/L)：(NH4)2SO40.24，丁二酸鈉2.17，維氏鹽溶液50mL，瓊脂20(固體培養基加入)，pH值=7.0。

(3)維氏鹽溶液(g/L)：K2HPO4·3H2O 6.50，MgSO4·7H2O 2.50，NaCl 2.50，FeSO4·7H2O 0.05，MnSO4·H2O 0.04 。

(4)好氧反硝化培養基(DM)(g/L)：把異養硝化培養基中的氮源改成KNO30.72，其它同異養硝化培養基，pH值=7.0。

(5)LB培養基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 5，葡萄糖2，瓊脂20(固體培養基加入)，pH值=7.0～7.2。

2.2異養硝化-好氧反硝化細菌的分離篩選

分離純化菌株主要運用梯度稀釋平板法和平板劃線法[7]。將樣品稀釋液涂布于異養硝化固體培養基上培養，待長出單菌落，挑取不同形態菌落進行多次劃線分離后得到純菌株，將其接種到斜面培養基中保存并編號。結合格林斯試劑法[8]和BTB法[9]，對分離得到的菌株進行異養硝化活性和好氧反硝化活性的鑒別，初步判斷篩選的菌株是否為異養硝化-好氧反硝化菌。將初篩得到的菌株接種于異養硝化液體培養基中進行培養，測定氨氮的含量并計算脫氮率，選取脫氮效果較好的菌株作為實驗菌株進行后續研究。

2.3菌株的鑒定

2.3.1形態學鑒定

將待鑒定的菌株接種到LB培養基平板上，28 ℃培養48h后觀察菌落特征；并挑取少量菌體制片進行革蘭氏染色和芽孢染色，然后光鏡觀察菌體形態；同時，用JSM-6500F掃描電子顯微鏡觀察菌體形態并攝像。

2.3.1生理生化鑒定

菌株的生理生化特性采用細菌自動鑒定系統進行測定。

2.3.216SrDNA序列測定與系統發育分析

16SrDNA測序由鉑尚生物技術(上海)有限公司完成。將所得序列信息提交GenBank數據庫BLAST比對后，選擇同源性較高的相關序列，由Clustal X序列比對軟件進行多序列匹配，然后由Mega 4.0構建菌株JB4的16SrDNA系統進化樹。

2.4生長及脫氮曲線

2.5分析方法

硝態氮的測定采用麝香草酚分光光度法[10]；氨氮的測定采用納氏試劑分光光度法；亞硝態氮的測定采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法[11]；菌體生長量測定采用濁度法(OD600)。

3　結果和分析

3.1異養硝化-好氧反硝化菌株的分離與鑒定

經多次分離純化，篩選得到一株具有較高脫氮能力的異養硝化-好氧反硝化菌株，命名為JB4。

3.1.1形態學鑒定

菌株JB4在LB培養基平板上28 ℃培養48 h后呈現的菌落特征為：圓形，白色，表面褶皺，有光澤，邊緣呈波狀，不透明。菌落直徑為0.3～0.8 cm。菌株JB4革蘭氏染色陽性，細胞呈直桿狀、有芽孢，菌體大小為(0.57～0.95) μm×(1.71～3.8) μm，如圖1所示。

圖1　菌株JB4掃描電子顯微鏡圖片(×8000)

3.1.2生理生化特性

菌株JB4的生理生化特性為：兼性厭氧；可以在含有海藻糖、蔗糖、D-甘露糖、D-甘露醇、葡萄糖、D-核糖培養基上生長并產酸，不能在含有D-棉子糖、D-麥芽糖、乳糖、D-山梨醇、D-木糖培養基上生長并產酸；精氨酸雙水解酶1陽性，精氨酸雙水解酶2陰性；L-乳酸鹽產堿陽性；酪氨酸芳胺酶、α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶陽性。該菌株能在鹽度為6.5%的培養液中生長。

3.1.316SrDNA序列測定與系統發育分析

提取并測定片段長度為1417bp的16SrDNA序列。此序列在NCBI數據庫中進行同源性比較，結果顯示菌株JB4和多株Bacillus sp.16SrDNA的相似性達99%以上，結合菌株的形態特征和生理生化特性，初步鑒定其為Bacillus sp.。選取同源性較高的序列用Mega 4.0軟件，以Neighbor-joining法繪制系統進化樹。

3.2JB4生長曲線及脫氮性能

菌株JB4在初始硝態氮濃度為442 mg/L的好氧反硝化培養基中的生長曲線如圖2(B)所示。由OD600變化可知，菌株JB4在0～4 h是延遲期， 4～12 h為對數期，16 h后OD600達到最大值0.642，20 h降至0.546，之后保持穩定，基本與在異養硝化培養基中的生長規律一致。由硝態氮的質量濃度變化可知，菌株JB4培養4h后的硝態氮由442 mg/L降至70.30 mg/L，脫氮率達到84.09%，12h后降到最低61.58 mg/L，脫氮率達到86.07%。反硝化過程的第一步是還原成亞硝態氮，然后再轉變成N2O和N2。由劉俊女的研究[12]可知，亞硝態氮的累積與脫氮中間產物N2O的生成有正相關關系，而該實驗中的亞硝態氮的累積量很小，最高也不超過1.83 mg/L，可以推測脫氮過程中N2是最主要的最終脫氮產物。與已報道的相關菌株X3和XF3相比[4,6](菌株X3經12h培養，硝態氮濃度從初始42 mg/L降到29.80 mg/L，去除率為29.05%，培養18h時硝態氮降至12.32 mg/L，去除率為70.67%；菌株XF3經48 h培養，硝態氮濃度可從初始84 mg/L降到9 mg/L，脫氮率高達89.3%，但是亞硝態氮積累量達到11.22 mg/L)，菌株JB4硝態氮去除速率更高。此結果說明菌株JB4具備高效的好氧反硝化能力，且反硝化作用主要發生在菌株生長的對數期。

圖2菌株JB4在異養硝化(A)和好氧反硝化培養基(B)中的生長降解曲線

4　結論

(1)從福矛酒廠的堆積樣中分離到一株異養硝化-好氧反硝化細菌JB4。JB4生長迅速、脫氮效果高，亞硝態氮積累量低于1.83 mg/L。

(2)經形態觀察、生理生化特性鑒定及16SrDNA序列分析，將JB4鑒定為芽孢桿菌屬細菌(Bacillus sp.)。

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2016-07-04

福建省自然科學基金項目(編號：2013J01123)

李泳洪(1994—)，男，福建師范大學生命科學學院學生。

許旭萍(1962—)，女，教授，主要從事廢水微生物處理技術研究。

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1674-9944(2016)16-0023-03