鈣激活氯通道密度調節Anoctam in 1電流作用的研究

馬可，王慧，王清華，雒舒雅，肖慶桓

（中國醫科大學藥學院離子通道藥理研究室，沈陽 110122）

鈣激活氯通道密度調節Anoctam in 1電流作用的研究

馬可，王慧，王清華，雒舒雅，肖慶桓

（中國醫科大學藥學院離子通道藥理研究室，沈陽 110122）

目的研究鈣激活氯通道（CaCCs）密度對CaCCs蛋白—Anoctamin 1（Ano1）電流特性的調節作用，探討高表達Ano1促進腫瘤發生的機制。方法瞬時轉染Ano1質粒到HEK293細胞，高密度CaCCs通過表達Ano1 24 h獲得，低密度CaCCs通過表達Ano1 6 h獲得。膜片鉗方法檢測鈣離子激活的Ano1的全細胞電流。激活電流曲線以指數曲線擬合。結果Ano1質粒表達6 h的電流密度顯著低于表達24 h的電流密度（P＜0.05）。在低CaCCs密度時，Ano1的激活電流曲線最適于用單指數擬合，τslow為（292.71±38.11）ms。在高CaCCs密度時，Ano1的激活電流曲線最適于用兩指數擬合，τfast為（47.78±4.58）ms；τslow為（385.74± 71.44）ms。高CaCCs密度下的Ano1電流比低CaCCs密度下的Ano1電流多了一個快速激活成分（τfast），而高CaCCs密度與低CaCCs密度比較Ano1的τslow差異沒有統計學意義（P＞0.05）。結論CaCCs的密度可調節Ano1激活的動力學變化；高表達Ano1可促進CaCCs的激活。

Anoctam in 1；鈣激活氯通道；通道密度；激活動力學；腫瘤

鈣激活氯通道（calcium-activated chloride channels，CaCCs）Anoctamin 1（Ano1，TNEN16A）是Anoctamin家族10個成員之一，參與上皮細胞分泌、神經及心肌細胞興奮性、平滑肌收縮、嗅覺和光感傳導、疼痛等多種重要生理功能［1］。早在2008年Ano1被確定為鈣激活氯離子通道蛋白之前，Ano1也被稱為ORAOV2、DOG1、TAOS2和DLJ0261，在食管鱗狀上皮癌、胃腸道間質瘤、頭頸鱗狀細胞癌等多種癌癥中高表達［2］。近年來又有研究陸續發現Ano1在乳腺癌［3］、前列腺癌［4］、胰腺導管腺癌［5］、胃癌［6］等腫瘤中也高表達。11q13區段擴增被認為是腫瘤過高表達Ano1的機制［7］。另外，抑制組蛋白去乙?；改芙档腿橄侔┘毎鸄no1表達，表明組蛋白去乙?；竿ㄟ^表觀遺傳調控方式促進乳腺癌中Ano1的高表達［8］。在ER陰性乳腺癌中，PR陽性的腫瘤中Ano1表達量比在PR陰性的高，表明ER和PR信號通路可能參與調控Ano1在乳腺癌中的表達［3］。

研究報道，在頭頸鱗狀細胞癌細胞系中，Ano1可以通過激活ERK1/2通路調節其下游clinD1表達水平升高［9］；在乳腺癌細胞系中，Ano1可以通過激活表皮生長因子受體通路和鈣調蛋白激酶通路促進細胞增殖［10］；提示Ano1氯通道可能對促進腫瘤細胞增殖起到重要作用。但是，Ano1過表達導致的過高通道密度是否會調節Ano1電流特性目前尚不清楚。

本研究擬通過瞬時轉染Ano1質粒到HEK293細胞，觀察表達時間不同而獲得含有不同Ano1密度的HEK293細胞，應用膜片鉗方法檢測Ano1密度對其電流特性的影響。探討CaCCs密度對Ano1電流特性的調節作用及高表達Ano1促進腫瘤發生的機制。

1　材料與方法

1.1細胞培養和轉染

HEK-293細胞購于美國菌種保藏中心，于37℃、5%CO2培養箱內，在含10%胎牛血清、0.5%青鏈霉素的DMEM高糖培養液中培養。待細胞70%～80%時棄培養液。參照Fugen-6試劑說明操作，在HEK293細胞中瞬時轉染Ano1質粒（1 μg）。細胞中同時轉染1 μg EGFP用于熒光檢測。細胞于37℃、5%CO2培養箱內培養6 h和24 h后進行膜片鉗實驗。

1.2膜片鉗記錄鈣激活氯電流

轉染Ano1后的HEK293細胞在熒光顯微鏡下進行全細胞膜片鉗實驗，電極電阻為2～4 M?。應用Clampfit9，通過AxoPatch 200B膜片鉗放大器和Digidata1322A采集數據（MD，美國）?！盁o鈣”電極內液含146 mmol/L CsCl，2 mmol/L MgCl2，5 mmol/L EGTA，10 mmol/L蔗糖，8 mmol/L HEPES，應用NMDG調節至pH 7.3?！案哜}”電極內液用5 mmol/L Ca2+-EGTA替代EGTA，其游離鈣離子濃度約為25 μmol/L。1 μmol/L鈣離子濃度的電極內液通過由“無鈣”和“高鈣”電極內液按照1∶9的比例配制而成，游離鈣離子濃度用Fure-2和Fura 6F（Invitrogen）驗證。細胞外液含140 mmol/L NaCl，4 mmol/L KCl，2 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2，10 mmol/L葡萄糖和10 mmol/L HEPES（pH 7.3）。所有液體滲透壓均用蔗糖調至305 mOsm。細胞電壓鉗制在0 mV，刺激電壓為-100 mV～+100 mV，步階電壓20 mV，刺激時間為700 ms。

圖1　轉染Ano1質粒6 h及24 h后的HEK293細胞Ano1電流密度Fig.1　Channe l current density of Ano1 in HEK293 cells after transient transfection w ith Ano1 p lasm id for 6 h and 24 h

1.3數據分析

應用Origin 7軟件進行分析數據和圖像制作。激活電流曲線由單指數或兩個指數擬合而成。應用t檢驗比較組間差異，檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1不同轉染時間對Ano1電流密度的影響

應用膜片鉗檢測瞬轉Ano1質粒后表達Ano1蛋白6 h和24 h的HEK293細胞的鈣激活氯電流結果顯示，在1 mmol/L鈣離子條件下，HEK細胞記錄到鈣激活的氯電流，電流呈現強烈的外向整流和時間依賴性激活的特性（圖1），符合鈣離子激活Ano1的電流特性［11］。在+100 mV的條件下，Ano1質粒表達6 h的電流密度為（103.68±28.62）pA/pF；Ano1質粒表達24 h的電流密度為（482.12±65.70）pA/pF，2者比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2通道密度對Ano1電流激活動力學的影響

結果顯示，在低通道密度時，Ano1電流激活只有緩慢激活成分（τslow），Ano1的激活電流曲線最適于用單指數擬合，τslow為（292.71±38.11）ms；在高通道密度時，Ano1電流激活包括快速激活成分（τfast）和緩慢激活成分（τslow），Ano1的激活電流曲線最適于用兩指數擬合，τfast為（47.78±4.58）ms；τslow為（385.74±71.44）ms。高通道密度Ano1的τslow與低通道密度比較沒有統計學差異（P＞0.05）。

3　討論

盡管Ano1高表達促進腫瘤發生發展的機制還不清楚，但有研究［10］結果證明，高表達Ano1可以激活ERK1/2通路、EGFR通路及CAMK等多種信號通路。另外，Ano1的氯通道功能有促進腫瘤細胞增殖的作用［12］。高表達Ano1是否對Ano1的氯通道有調節作用還未見報道。

Mazzanti等［13］報道L型電壓依賴性鈣通道的電流特性受通道密度調節，本研究發現Ano1質粒表達24 h的電流密度比表達6 h的電流密度顯著增加，表明Ano1質粒表達24 h導致了通道密度增高。高通道密度下的Ano1電流激活包括兩個組成成分：快速激活成分（τfast）和緩慢激活成分（τslow）。低通道密度下的Ano1電流激活只有緩慢激活成分。前期研究［14］表明快速激活成分和電壓依賴性激活Ano1相關，而緩慢激活成分和鈣離子依賴性激活Ano1相關；通透的陰離子可以調控電壓依賴性門控Ano1通道［11］。本研究發現，高密度Ano1可能通過調節電壓依賴性激活Ano1，而不影響鈣離子依賴性激活Ano1；高密度通道調節電壓依賴性激活Ano1，即在高通道密度的條件下，通透的陰離子增加，而高通透的陰離子可能作為電壓感受器，促進電壓依賴性激活Ano1。

由于Ano1快速通透氯離子可以更快調控細胞的膜電位［11］，進而可能參與腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移等生物學行為［10］，本研究發現高表達Ano1能夠加速Ano1激活，說明高表達Ano1可能促進通道處于激活狀態。本研究可能為進一步闡明高表達Ano1促進腫瘤發生發展提供了一個新的思路。

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（編輯武玉欣）

EffectofCa2+-activated ChlorideChannelDensity on Gating Propertiesof Anoctam in 1

MAKe，WANGHui，WANGQing-hua，LUOShu-ya，XIAOQing-huan
（Departmentof Ion ChannelPharmacology，SchoolofPharmacy，ChinaMedicalUniversity，Shenyang 110122，China）

ObjectiveTo investigate theeffectofchanneldensityon thegatingpropertiesofAnoctamin1（Ano1，TMEM16A）Ca2+-activated chloride channel.MethodsAno1 expression plasmids were transiently transfected into HEK293 cells.High density and low density of Ano1 was obtained after expressing the protein for 24 h and 6 h，respectively.Electrophysiological recordings were performed in the whole-cell patch clamp configuration.The activation kinetics of current traces was fitted by exponentials.Results The current density was significantly higher in cells expressing Ano1 for24 h than thoseexpressingAno1 for6 h（P＜0.05）.Theactivation ofAno1 currentin cellswith low densitywaswellfitbyasingleexponentialwithτslowof292.71±38.11ms.Theactivation ofAno1 currentin cellswith high densitywaswellfitby twoexponentialswithτfastof47.78±4.58 ms and τslowof 385.74±71.44 ms.ANO1 current in cells with high density has a rapid active component（τfast）more than low density.There was no significantlydifferentoftheτslowbetween cellswithhigh densityand low densityofAno1（P＞0.05）.ConclusionOur findingssuggested thatchanneldensity regulatesthegatingofAno1.High channeldensity promotesactivationofAno1.

Anoctamin1；Ca2+-activated chloride channel；channel density；activation kinetics；tumor

R966

A

0258-4646（2016）04-0298-03

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.04.003

國家自然科學基金（31371145；81572613）

馬可（1989-），女，助教，碩士.

肖慶桓，E-mail：qinghuanxiao12345@163.com

2015-10-16

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