PP242對人晶狀體上皮細胞凋亡相關蛋白Bcl-2表達的影響

白雪，馮浩，張柳，楊志博，寧宏

（中國醫科大學附屬第一醫院眼科，沈陽 110001）

·論著·

PP242對人晶狀體上皮細胞凋亡相關蛋白Bcl-2表達的影響

白雪，馮浩，張柳，楊志博，寧宏

（中國醫科大學附屬第一醫院眼科，沈陽 110001）

目的探討PP242對人晶狀體上皮細胞凋亡相關蛋白Bcl-2表達的影響。方法采用不同濃度PP242處理培養傳代的永生系人晶狀體上皮細胞系SRA01/04。采用MTT法檢測處理24、48 h后的細胞生長抑制率，采用實時定量RT-PCR和免疫印跡法檢測不同濃度PP242處理48 h后Bcl-2mRNA和蛋白表達水平的變化情況。結果100、250、500、750、1 000、1 500 nmol/L PP242對人晶狀體上皮細胞SRA01/04作用24、48 h后，細胞生長抑制率24 h組分別為7.55%、9.43%、16.98%、22.64%、26.42%、30.19%，48 h組分別為11.11%、23.81%、36.51%、42.86%、49.21%、63.49%，與對照組（0 nmol/L）比較，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。免疫印跡法檢測結果顯示：在相同作用時間內，隨著PP242藥物濃度的增加，Bcl-2蛋白的表達水平逐步下降，與對照組（0 nmol/L）比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。實時定量RT-PCR檢測結果顯示：在相同作用時間內，隨著PP242藥物濃度的增加，Bcl-2mRNA表達水平亦逐步下降；mRNA相對表達量分別為0.723±0.039，0.517±0.028，0.353±0.052，0.167±0.046，與對照組（0 nmol/L）比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論PP242能夠抑制體外培養的人晶狀體上皮細胞的生長，呈濃度和時間依賴性。人晶狀體上皮細胞中存在Bcl-2的表達，PP242可下調其表達。

PP242；人晶狀體上皮細胞；Bcl-2

白內障摘除術后或晶狀體外傷后，殘留的皮質或赤道部晶狀體上皮細胞增生、向后囊膜移行并化生，形成混濁，稱為后發性白內障（posterior capsule opacification，PCO）。多種生長因子、細胞外基質以及細胞凋亡是目前已知的PCO主要分子生物學基礎，因此，目前基礎研究的重點是如何抑制晶狀體上皮細胞增殖并誘導晶狀體上皮細胞凋亡。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammal target of rapamycin，mTOR）信號通路與多種細胞的生長、增殖、分化、凋亡等密切相關，被認為是調節細胞周期進程和凋亡的信號匯聚點［1］。PP242是一種新型的mTOR抑制劑，具有抑制乳腺癌、結腸癌等腫瘤細胞的生長及誘導腫瘤細胞凋亡的作用［2］。本研究擬應用不同濃度PP242對體外培養的人晶狀體上皮細胞系SRA01/04進行處理，觀察PP242對人晶狀體上皮細胞凋亡基因Bcl-2表達的影響，探討PP242對PCO的發生發展的作用。

1　材料與方法

1.1材料

人晶狀體上皮細胞系SRA01/04細胞株（北京中國科學院腫瘤研究所）；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養基（美國Hyclone公司）；PP242（美國LC公司）；MTT試劑（中國碧云天生物公司）；兔抗人β-actin單克隆抗體和辣根酶標記的山羊抗兔lgG二抗（美國Santa Cruz公司）；兔抗人Bcl-2抗體（美國Abcam公司）。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測SRA01/04細胞生長抑制情況：將對數生長期的細胞用胰酶消化后，將200 μL細胞懸液（約含10 000個細胞）接種到96孔板各孔。細胞貼壁生長后，棄原培養液，用無血清培養液培養12 h。實驗孔分別用含100、250、500、750、1 000、1 500 nmol/L PP242培養液處理細胞24 h和48 h，設對照孔（細胞和無血清培養液）和調零孔（無血清培養液），將實驗孔、對照孔及調零孔設5個平行孔。每孔加50 μL MTT，室溫孵育4 h。用酶標儀測波長490 nm的吸光度值（OD值），重復實驗3次。計算細胞生長抑制率（inhibitory rate，IR）=1-（OD實驗孔/ OD對照孔）×100%。

1.2.2細胞培養和分組：應用含10%胎牛血清的DMEM細胞培養液，在37℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養箱內培養SRA01/04細胞。選取對數生長期細胞傳代。細胞貼壁生長至亞匯合狀態時，更換無血清培養液12 h。將細胞分為對照組和實驗組。用含0 nmol/L PP242的培養液培養對照組細胞48 h；分別用含250、500、750、1 000 nmol/L PP242培養液培養實驗組細胞48 h。

1.2.3Western blot檢測Bcl-2蛋白表達情況：向各實驗組細胞內加入裂解液裂解細胞，4℃、13 000 r/min離心15 min，取上清測蛋白濃度。進行10% SDS-PAGE電泳，轉移蛋白至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加兔抗人Bcl-2單克隆抗體（1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜。TBST洗膜3次。加辣根酶標記山羊抗小鼠二抗，37℃孵育2 h，TBST洗膜3次，每次15 min。ECL發光，照相。

1.2.4實時定量RT-PCR檢測Bcl-2mRNA表達情況：提取細胞總RNA并檢測濃度。取2 μL RNA （500 ng/μL），逆轉錄cDNA。取2 μL cDNA模板，3個復孔，2步法實時定量RT-PCR擴增目的基因。βactin上游引物序列5′-GTGGACATCCGCAAAGA C-3′，下游引物序列5′-AAAGGG TGTAACGCAACT AA-3′；Bcl-2上游引物序列5′-GGATTGTGGC CTTCTTTGAG-3′，下游引物序列5′-TACCCA GCCTCCGTTATCCT-3′。根據β-actin與Bcl-2 mRNA表達量標準曲線回歸方程及實驗組Ct值，計算各實驗組β-actin和Bcl-2 mRNA的相對表達量。

1.3統計學分析

2　結果

2.1PP242對SRA01/04細胞生長的抑制情況（表1）

用不同濃度PP242處理SRA01/04細胞24 h、48h后，MTT法檢測細胞生長情況，結果顯示各組OD值均有統計學差異（P＜0.05）；相同作用時間內，隨著PP242濃度升高，OD值逐漸降低，表明對細胞生長的抑制率逐漸升高。相同藥物濃度下，隨著PP242處理細胞時間的增加，細胞的生長抑制率也逐漸提高。

表1　PP242對SRA01/04細胞生長的抑制情況（n=30,）Tab.1　The influence of PP242 on the proliferation of SRA01/04（n=30,）

表1　PP242對SRA01/04細胞生長的抑制情況（n=30,）Tab.1　The influence of PP242 on the proliferation of SRA01/04（n=30,）

Group　24 h　48 h OD value　IR（%）　OD value　IR（%）Control　0.53±0.19　0　0.63±0.23　0 PP242 100 nmol/L　0.49±0.17　7.55　0.56±0.37　11.11 250 nmol/L　0.48±0.15　9.43　0.48±0.61　23.81 500 nmol/L　0.44±0.17　16.98　0.40±0.13　36.51 750 nmol/L　0.41±0.06　22.64　0.36±0.57　42.86 1 000 nml/L　0.39±0.30　26.42　0.32±0.13　49.21 1 500 nmol/L　0.37±0.22　30.19　0.23±0.24　63.49

2.2PP242處理后SRA01/04細胞內Bcl-2蛋白的表達情況

Western blot結果顯示：SRA01/04細胞內有Bcl-2蛋白表達，且PP242濃度越高，Bcl-2蛋白表達水平越低（圖1）。各實驗組與對照組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1　Western blot法檢測PP242處理后SRA01/04細胞內Bcl-2蛋白的表達情況Fig.1　Exp ression o f Bcl-2 protein in SRA01/04 treated w ith different concentrations o f PP242 de term ined by Western blot

2.3PP242處理后SRA01/04細胞內Bcl-2mRNA的表達情況

實時定量RT-PCR結果顯示：各實驗組（250，500，750，1 000 nmol/L）細胞內Bcl-2 mRNA的相對表達量為0.723±0.039，0.517±0.028，0.353±0.052，0.167±0.046，與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。且隨著PP242濃度增加，細胞中Bcl-2 mRNA表達水平逐漸降低。

3　討論

PCO是白內障摘除術后最常見的并發癥。研究［3］表明，成人白內障摘除術后PCO發生率為30%～50%，兒童則為100%。隨著現代白內障手術技術日臻完美，人工晶狀體設計及材質不斷更新，PCO發生率有所下降。目前后囊膜截開術是治療PCO的行之有效的方法。但由于多數兒童患者自主配合能力較差，無法進行手術治療，而且可能會出現黃斑水腫甚至視網膜脫離等并發癥［4］。因此，PCO的藥物防治方法成為目前基礎研究的熱點。與腫瘤細胞相似，晶狀體上皮細胞凋亡能夠受到多種炎性因子及生長因子的抑制，因此，越來越多的研究將抗腫瘤藥物用于PCO的防治。磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphoinositide 3-kinases/protein kinase B/mammal target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR）通路是細胞生長凋亡過程中的經典的信號通路，激活mTOR通路可誘發腫瘤的生長。研究［6］表明，晶狀體上皮細胞的功能狀態與mTOR活性密切相關，激活mTOR通路可以抑制晶狀體上皮細胞增殖，誘導細胞凋亡。雷帕霉素是經典的PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑，可抑制腫瘤細胞生長，加速細胞凋亡，但其抑制作用具有一定的局限性，只對mTORC1有作用［7］。PP242是一種新型的mTOR抑制劑，通過阻斷細胞中負反饋、激活AKT途徑，對mTOR通路中mTORC1和mTORC2這2種復合物均有較強的抑制作用，因而，PP242在誘導細胞的凋亡方面比雷帕霉素效果更強［8］。本研究結果顯示，PP242對人晶狀體上皮細胞的增殖有較強的抑制作用，且在相同作用時間內對細胞生長的抑制率具有濃度依賴性；在相同藥物濃度下，對細胞生長的抑制率具有時間依賴性。同時，本研究結果還顯示低濃度的PP242即可抑制人晶狀體上皮細胞的增殖，高濃度的PP242可產生細胞毒性，引起細胞死亡。而較短時間（12 h）內，PP242對人晶狀體上皮細胞增殖的抑制作用并不顯著，較長時間（48 h）內，則抑制作用明顯。

細胞凋亡是多基因嚴格控制的過程，其中Bcl-2家族起關鍵性作用。Bcl-2是AKT下游效應分子中公認的抑制凋亡的原癌基因［9］，Bcl-2蛋白主要分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白2類。Bcl-2是Bcl-2家族蛋白中的抗凋亡蛋白，平時被隔離在線粒體等細胞器內，能夠抑制細胞色素c和凋亡誘導因子等促凋亡因子的釋放，具有抑制細胞凋亡的功能。而當細胞發生凋亡時，Bcl-2失活，線粒體等細胞器受到破壞，釋放出大量的促凋亡因子［10］。本研究結果表明，正常人晶狀體上皮細胞中存在Bcl-2蛋白的表達，隨著PP242濃度的增加，人晶狀體細胞中Bcl-2蛋白的表達逐漸減弱；實時定量RT-PCR檢測結果顯示，正常人晶狀體上皮細胞中Bcl-2mRNA的表達量較高，隨著PP242濃度增高，Bcl-2的表達逐漸減弱。因此，PP242使人晶狀體上皮細胞中抗凋亡基因Bcl-2的表達水平降低，從而減弱了Bcl-2對人晶狀體上皮細胞凋亡的抑制作用。

綜上所述，PP242能夠抑制人晶狀體上皮細胞的增殖，并可能通過下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達而增加細胞凋亡。然而，在本研究中僅觀察到PP242下調Bcl-2表達的現象，而PP242抑制人晶狀體上皮細胞增殖、誘導人晶狀體上皮細胞凋亡的分子機制仍有待進一步研究。

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（編輯王又冬）

EffectsofPP242on theExpression of ApoptosisProtein Bcl-2 in Human LensEpithelialCells

BAIXue，FENGHao，ZHANGLiu，YANGZhi-bo，NINGHong
（DepartmentofOphthalmology，The FirstHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveToexplore theeffectsofPP242 on theexpression ofapoptosisprotein Bcl-2 in human lensepithelialcells（HLECs）.MethodsImmortal HLECs SRA01/04 were cultured and treated with different concentrations of PP242.The cell growth was examined by MTT assay at 24 h and 48 h after PP242 treatment.Real-time quantitative polymerase chain reaction（RT-PCR）and Western blot were adopted to detect the mRNA and protein expression of Bcl-2 respectively.Results The cultured HLECs SRA01/04 were collected and treated with different concentrations（100，250，500，750，1 000，1 500 nmol/L）of PP242.After treatment for 24 h and 48 h，the inhibitory rate in each well was determined by MTTassay.Theinhibition ratewasasbelow，24h：7.55%，9.43%，16.98%，22.64%，26.42%，30.19%；48h：11.11%，23.81%，36.51%，42.86%，49.21%，63.49%.Compared with the control group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Compared with the control group（0 nmol/L），the expression of Bcl-2 protein was significantly decreased with the increasing concentrations of PP242（P＜0.05），while the expression of Bcl-2mRNA was inhibited by PP242 based on the results of RT-PCR.Compared with the control group（0 nmol/L），the RT-PCR results of Bcl-2 mRNA were 0.723±0.039，0.517±0.028，0.353±0.052，0.167±0.046，respectively（P＜0.05）.ConclusionPP242 could inhibit cell proliferation of HLECs in vitro with a concentration and time depended manner.Bcl-2 protein is expressed in HLECs，which could be down regulated by PP242 treatment.

PP242；human lens epithelial cells；Bcl-2

R776.1

A

0258-4646（2016）04-0324-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.04.009

遼寧省社會發展攻關計劃（2013225303）

白雪（1986-），女，醫師，碩士研究生.

寧宏，E-mail：xiaoxiao1998@21cn.com

2015-12-21

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