肺癌中異常增高的RAD21的臨床意義及潛在功能預(yù)測

谷學(xué)靜，吳月明，高靜

（遼寧醫(yī)學(xué)院1.人體解剖學(xué)教研室；2.附屬第三醫(yī)院腫瘤科；3.附屬第一醫(yī)院超聲科，遼寧 錦州 121001）

肺癌中異常增高的RAD21的臨床意義及潛在功能預(yù)測

谷學(xué)靜1，吳月明2，高靜3

（遼寧醫(yī)學(xué)院1.人體解剖學(xué)教研室；2.附屬第三醫(yī)院腫瘤科；3.附屬第一醫(yī)院超聲科，遼寧 錦州 121001）

目的檢測肺癌組織中RAD21（S.Pombe RAD21同系物）的表達(dá)水平，探討其潛在臨床意義及功能。方法采用Western blot和免疫組織化學(xué)方法檢測肺癌組織中RAD21的表達(dá)水平；通過Oncom ine（腫瘤微陣列數(shù)據(jù)庫）分析RAD21mRNA在肺癌中的表達(dá)情況；應(yīng)用Kaplan-Meier分析RAD21的表達(dá)水平與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系；采用基因集富集分析方法預(yù)測RAD21在肺癌中的功能。結(jié)果與癌旁組織相比，肺癌組織中RAD21蛋白的表達(dá)水平增高。Oncomine數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，多個(gè)肺癌基因芯片中RAD21的mRNA水平明顯增高（P＜0.01）。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果顯示，RAD21的表達(dá)水平與肺癌患者的生存時(shí)間存在相關(guān)性（P＜0.05）；基因集富集分析顯示，RAD21主要富集于細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的信號通路。結(jié)論肺癌中RAD21的表達(dá)水平可作為判斷肺癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。RAD21可能通過調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡參與肺癌的發(fā)生和發(fā)展。

肺癌；RAD21；預(yù)后；免疫組織化學(xué)

人RAD21基因位于染色體8q24.11，編碼與DNA雙鏈斷裂修復(fù)有關(guān)的核內(nèi)蛋白質(zhì)，是粘連復(fù)合體的組成成員［1］。研究表明，RAD21基因不僅能夠保持姐妹染色單體結(jié)合并確保正確的復(fù)制［2］，還參與了DNA雙鏈斷裂修復(fù)及減數(shù)分裂重組等過程［3，4］。研究顯示，RAD21在結(jié)直腸癌［5，6］、子宮內(nèi)膜癌［7］、乳腺癌［8，9］等多種腫瘤中表達(dá)異常，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后判斷及治療存在密切關(guān)聯(lián)。本研究擬探討RAD21基因在肺癌組織中的表達(dá)，并預(yù)測其在肺癌中的功能，探究該基因在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來源：25例肺癌及癌旁組織均來自遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除的肺癌及癌旁組織。其中，腺癌17例，鱗癌8例。組織均經(jīng)含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，厚5 μm。全部診斷均經(jīng)病理證實(shí)，術(shù)前均無化療、放療及免疫治療史。

1.1.2主要試劑：RAD21兔抗人多克隆抗體、β-actin鼠抗人單克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗以及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗（美國Invitrogen公司）；蛋白預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)參照物（美國Fermentas公司）。

1.2方法

1.2.1肺癌及癌旁組織中RAD21蛋白表達(dá)水平檢測：向肺癌及癌旁組織中加入RIPA裂解液，靜置20 min。4℃、12 000 r/min離心20 min，留取上清液，BCA法測定蛋白含量。電泳（100 V），轉(zhuǎn)膜，5%BSA室溫封閉1 h。加入兔抗人RAD21多克隆抗體（1∶800稀釋），4℃孵育過夜，TBST洗脫3次，每次5 min。HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶5 000稀釋）孵育1 h，TBST洗脫3次，每次5 min。ECL顯色后X線曝光。采用β-actin作為內(nèi)參。

1.2.2Oncomine數(shù)據(jù)庫中RAD21的表達(dá)譜分析：在Oncomine數(shù)據(jù)庫（http：//www.oncomine.com）中查詢RAD21表達(dá)譜，先限定“Analysis Type：Lung Cancer vs Nornlal Analysis”，再輸入基因名稱RAD21，檢索獲得肺癌相關(guān)數(shù)據(jù)集。限定P＜0.001的過濾選項(xiàng)，View box plot。

1.2.3免疫組織化學(xué)染色：組織切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫15 min，枸櫞酸鹽微波修復(fù)，羊血清清蛋白封閉30 min。分別滴加兔抗RAD21多克隆抗體（1∶200稀釋），濕盒中4℃過夜，加二抗37℃溫箱孵育30 min，加SABC 37℃溫箱孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。光學(xué)顯微鏡下觀察并照相。采用雙盲法觀察RAD21免疫組化染色結(jié)果：以細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。

1.2.4生存分析：從公共基因芯片數(shù)據(jù)庫Gene Expression Omnibus（GEO）中尋找并下載肺癌基因芯片數(shù)據(jù)，將肺癌患者按照RAD21的表達(dá)水平進(jìn)行排序，進(jìn)而分為高表達(dá)與低表達(dá)組，再應(yīng)用Graphpad Prism5軟件進(jìn)行Kaplan-Meier分析，繪制生存函數(shù)曲線，用log-rank檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

1.2.5基因集富集分析（gene sets enrichment analysis，GSEA）：肺癌樣本數(shù)據(jù)集 GSE10245被納入GSEA。采用GSEA 2.0.14版軟件進(jìn)行分析。根據(jù)RAD21的表達(dá)水平將腫瘤組織樣本分為高表達(dá)和低表達(dá)2組，之后通過GSEA法分析RAD21的表達(dá)水平對各種生物功能基因集的影響。首先，從GSEA網(wǎng)站MsigDB數(shù)據(jù)庫中獲得與生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因集作為參照基因集；然后，按缺省加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)的方法進(jìn)行富集分析，設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)為1 000次。

2　結(jié)果

2.1肺癌組織中RAD21蛋白的表達(dá)情況

Western blot檢測結(jié)果顯示：與癌旁組織相比，RAD21在肺癌組織中的蛋白表達(dá)水平明顯增高（圖1）。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：RAD21陽性染色主要分布于細(xì)胞核以及細(xì)胞質(zhì)，表現(xiàn)為大小不一的棕黃色顆粒（圖2），癌旁組織中RAD21的染色較弱（圖2A），相反，肺癌組織中RAD21染色較強(qiáng)（圖2B）。提示肺癌中RAD21的表達(dá)水平增高，RAD21可能在肺癌中發(fā)揮癌基因的作用。

圖1　Western blot方法檢測肺癌及癌旁組織中RAD21的蛋白表達(dá)水平Fig.1　The protein level of RAD21 in the peritumor lung tissues and lung cancer tissues detected by Western blot

2.2腫瘤數(shù)據(jù)庫肺癌基因芯片中RAD21基因的表達(dá)情況

在Oncomine公共數(shù)據(jù)庫中查詢RAD21基因在肺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：RAD21基因在肺癌組織中呈高表達(dá)（P＜0.001）（圖3），進(jìn)一步支持了本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3RAD21基因表達(dá)水平與肺癌患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)

分析GEO數(shù)據(jù)庫基因芯片數(shù)據(jù)中RAD21的表達(dá)與肺癌患者生存時(shí)間的關(guān)系，繪制Kaplan-Meier生存曲線（圖4），結(jié)果顯示：RAD21的表達(dá)水平對患者的總生存時(shí)間有顯著影響，與高表達(dá)組相比，RAD21低表達(dá)組腫瘤患者存活時(shí)間、無病生存時(shí)間以及復(fù)發(fā)時(shí)間均較長（圖4）。

圖2　免疫組織化學(xué)方法檢測肺癌及癌旁組織中RAD21的表達(dá)情況×200Fig.2　The expression of RAD21 in the peritumor lung tissues and lung cancer tissues detected by immunohistom chem ical staining ×200

圖3　 RAD21 m RNA在肺癌芯片數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)水平Fig.3　The exp ression levels of RAD21m RNA in lung cancer datasets

2.4 RAD21基因與細(xì)胞周期基因集密切相關(guān)

用GSEA方法分析肺癌樣本數(shù)據(jù)集GSE10245 中RAD21的表達(dá)對各種生物學(xué)功能基因集的影響，結(jié)果顯示：RAD21高表達(dá)的腫瘤樣本富集了與細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因集（圖5）。說明RAD21可能通過影響腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡能力促進(jìn)肺癌的發(fā)展。

3　討論

研究［10～12］表明，RAD21作為粘連復(fù)合體成員之一，參與了細(xì)胞的多種生理過程。最近的研究［5～9］表明，RAD21與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。本研究結(jié)果顯示肺癌組織中RAD21的表達(dá)水平增高，并與患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)。本研究還用生物信息學(xué)方法推測了RAD21在肺癌中的作用，提示RAD21基因可能作為新的癌基因在肺癌中發(fā)揮重要作用。

本研究用免疫印跡法和免疫組織化學(xué)分析證實(shí)了肺癌中RAD21蛋白表達(dá)水平明顯增高，同時(shí)，肺癌的多個(gè)微陣列數(shù)據(jù)也得到相似的結(jié)果。RAD21基因位于染色體8q24，該染色體區(qū)域在小細(xì)胞肺癌中存在擴(kuò)增，其中一些癌基因（如C-MYC［13］）已經(jīng)被確定。因此，RAD21在肺癌中異常表達(dá)的臨床意義以及生物學(xué)功能值得深入探討。

對基因芯片的分析結(jié)果表明，RAD21高表達(dá)的肺癌患者預(yù)后較差，這與乳腺癌或KRAS突變的結(jié)直腸癌研究［6，8］結(jié)果類似，在這些腫瘤中，RAD21的高水平表達(dá)預(yù)示不良預(yù)后。因此，RAD21可能作為肺癌預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。

本研究通過GSEA方法［14］對肺癌基因芯片進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺癌中RAD21與調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因集和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因集密切相關(guān)。有研究［15］表明，RAD21基因在乳腺癌中過表達(dá)，當(dāng)沉默RAD21時(shí)，可以引起明顯的細(xì)胞周期阻滯以及細(xì)胞凋亡，從而影響細(xì)胞活性。在染色質(zhì)聚集、核碎裂前的細(xì)胞凋亡早期，RAD21蛋白可被剪切成分子量為64 000的小片段，發(fā)揮正反饋效應(yīng)，擴(kuò)大細(xì)胞死亡信號，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］。大量研究［3，4］已證實(shí)，RAD21作為保持姐妹染色單體結(jié)合并、確保正確復(fù)制的關(guān)鍵因素，參與了DNA雙鏈斷裂修復(fù)及減數(shù)分裂重組等過程，這些都是與細(xì)胞周期密切相關(guān)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，盡管本研究組的初期實(shí)驗(yàn)未深入研究RAD21對肺癌惡性生物學(xué)行為的影響，但是生物信息學(xué)的分析結(jié)果提示，RAD21可能通過影響以上環(huán)節(jié)參與肺癌的惡性演進(jìn)過程。

圖4　 RAD21表達(dá)水平與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系。Fig.4　The relationship between RAD21 expression level and the p rognosis of patients with lung cancer

圖5　肺癌中RAD21的GSEA分析Fig.5　GSEA analysis of RAD21 in lung cancer

綜上所述，本研究證實(shí)了RAD21在肺癌中的異常表達(dá)情況及其在臨床預(yù)后判斷中應(yīng)用的可能性，并預(yù)測了其在肺癌中可能的生物學(xué)功能，為后續(xù)深入探究其在肺癌的惡性演進(jìn)過程所起到的作用及機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。

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（編輯王又冬）

ClinicalSignificanceand FunctionalPrediction ofUp-regulated RAD21 in Lung Cancer

GUXue-jing1，WUYue-ming2，GAOJing3
（1.DepartmentofHuman Anatomy，LiaoningMedicalUniversity，Jinzhou 121001，China；2.DepartmentofOncology，TheThird Affiliated Hospitalof LiaoningMedicalUniversity，Jinzhou 121000，China；3.DepartmentofUltrasound，TheFirstAffiliated Hospitalof LiaoningMedicalUniversity，Jinzhou 121001，China）

ObjectiveTo detect the expression levels of RAD21（S.Pombe RAD21 homolog）in lung cancer，and assess its clinical significance and potential functions.Methods Theexpression levelofRAD21 in lung cancerwasdetermined byWestern blotand immunohistochemistrymethods；the RAD21mRNA expression in lung cancer was analyzed through Oncomine database；the relationship between the RAD21 expression levels and prognosis in patients with lung cancer was studied by Kaplan Meier curve；the RAD21 functions in lung cancer were predicted by using gene set enrichment analysis.Results Compared with adjacent normal tissue，the protein level of RAD21 in lung tissues were upregulated.The data from Oncomine database showed that RAD21mRNA levels were significantly higher than the normal control groups in multiple lung cancer datasets（P＜0.01）；inaddition，Kaplan-Meiersurvivalcurvesshowed thattheRAD21expression levelswascorrelatedwith thesurvivalofpatientswith lungcancer（P＜0.05）；gene set enrichment analysis indicated that RAD21 was mainly enriched in apoptotic signaling pathways and cell cycle regulation gene sets.ConclusionThe downregulated RAD21 could be used as a biomarker to assess the prognosis of lung cancer patients.In addition，RAD21maybe involved in theregulationofcellcycleandapoptosis，whichaffectsthedevelopmentand progressionoflungcancer.

lung cancer；RAD21；prognosis；immunohistochemistry

R34

A

0258-4646（2016）04-0328-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.04.010

遼寧省自然科學(xué)基金（2015020366）；遼寧省博士科研啟動基金（201501102）

谷學(xué)靜（1961-），女，高級實(shí)驗(yàn)師，本科.

高靜，E-mail：chenjingnan88@163.com

2015-10-16

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