特丁基對苯二酚抑制中波紫外線誘發HaCaT細胞氧化損傷

顧煒，馬賢德，金連峰，陳家惠

（1.遼寧中醫藥大學附屬醫院皮膚科，沈陽 110032；2.遼寧中醫藥大學教學實驗中心生物技術實驗室，沈陽 110847；3.遼寧中醫藥大學附屬醫院骨科，沈陽 110032；4.沈陽市第七人民醫院皮膚科，沈陽 110003）

·論著·

特丁基對苯二酚抑制中波紫外線誘發HaCaT細胞氧化損傷

顧煒1，馬賢德2，金連峰3，陳家惠4

（1.遼寧中醫藥大學附屬醫院皮膚科，沈陽 110032；2.遼寧中醫藥大學教學實驗中心生物技術實驗室，沈陽 110847；3.遼寧中醫藥大學附屬醫院骨科，沈陽 110032；4.沈陽市第七人民醫院皮膚科，沈陽 110003）

目的觀察特丁基對苯二酚（tBHQ）對中波紫外線紫外線B（UVB）誘發人永生化角質形成細胞HaCaT氧化損傷的影響，并探討其作用機制。方法將HaCaT細胞隨機分為4組：正常對照組（G1組）、單純紫外線輻射組（G2組）、25 μmol/L tBHQ預處理+紫外線輻射組（G3組）、50 μmol/L tBHQ預處理+紫外線輻射組（G4組）。二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯熒光探針法檢測細胞活性氧自由基含量；四甲基偶氮唑藍法檢測細胞增殖活性；Western blot檢測細胞內及細胞核內核因子E2相關因子2（Nrf2）蛋白表達；應用實時定量PCR檢測過氧化氫酶（CAT）和硫氧還蛋白（SRX）的mRNA表達。結果與G1組相比，G2組HaCaT細胞內活性氧自由基含量升高，細胞存活率下降；G3、G4組細胞分別經25和50 μmol/L tBHQ預處理后能明顯抑制UVB誘發HaCaT細胞氧化損傷，并存在劑量依賴性。與G2組相比，G3、G4組細胞內及細胞核內的Nrf2蛋白水平顯著增加，且細胞內CAT和SRX mRNA表達均明顯高于G2組。結論UVB可誘發HaCaT細胞發生氧化損傷；tBHQ可通過增加HaCaT細胞內Nrf2的蛋白表達，并促進其核轉位，從而激活Nrf2-抗氧化酶（CAT和SRX）通路，消除活性氧自由基而抑制USB誘發的氧化損傷。

特丁基對苯二酚；中波紫外線；HaCaT細胞；核因子E2相關因子2；氧化損傷

日光中的中波紫外線紫外線B（ultraviolet B，UVB）可以通過誘發其靶細胞表皮中的角質形成細胞氧化應激反應，而導致皮膚出現紅斑、炎癥、皮膚老化，甚至皮膚癌的發生。特丁基對苯二酚（tert-butylhydroquinone，tBHQ）是一種常見的抗氧化劑，研究表明tBHQ可以通過激活核因子E2相關因子2 （nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）發揮其抗氧化作用，但目前關于tBHQ能否抑制UVB誘發Ha-CaT細胞氧化損傷還未見報道。本研究建立人永生化角質形成細胞HaCaT紫外線輻射模型，觀察tBHQ 對UVB輻射導致HaCaT細胞氧化損傷的影響，并探討其作用機制。

1　材料與方法

1.1材料

人永生化角質形成細胞HaCaT購自上海生博生物醫藥科技有限公司。日光紫外線模擬器SUV-1000購自上海希格瑪高技術有限公司。tBHQ、四甲基偶氮唑藍、堿性磷酸酶標記的抗兔IgG、抗小鼠IgG、二甲基亞砜，購自美國Sigma公司；二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯熒光素探針、胎牛血清、DMEM、Trizol，購自美國Invitrogen公司；Nrf2、β-actin、Lamin A一抗，購自美國Santa Cruz公司；逆轉錄試劑盒及PCR擴增試劑盒，購自美國Applied Biosystem公司；核蛋白提取試劑盒，購自碧云天生物技術研究所。

1.2方法

1.2.1細胞培養與實驗分組：HaCaT細胞株用高糖DMEM培養基（含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、鏈霉素），在37℃、5%CO2孵育箱內培養。將細胞隨機分為4組：正常對照組（G1組）、單純紫外線輻射24 h組（G2組）、25 μmol/L tBHQ預處理12 h+紫外線輻射24 h組（G3組）；50 μmol/L tBHQ預處理12 h+紫外線輻射24 h組（G4組），其中G2、G3、G4組的紫外線劑量為60 m J/cm2。

1.2.2二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯熒光探針測定細胞內活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）含量：將各實驗組細胞制成單細胞懸液，濃度調整為1×106/mL，加入終濃度10 μmol/L二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯染液，避光，37℃孵育30 min。用熒光酶標儀收集熒光信號（激發波長488 nm，發射波長525 nm）。ROS水平以二氯熒光素熒光強度表示。

1.2.3四甲基偶氮唑藍法檢測細胞增殖活性：細胞分組處理后，每孔加入四甲基偶氮唑藍20 μL（濃度為5 g/L，用PBS配制），繼續避光培養4 h，終止培養，棄上清，加入150 μL的二甲基亞砜，在酶聯免疫檢測儀上測定波長為490 nm處各孔的吸光度，記錄結果。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達：收集并裂解細胞，超聲處理，離心，上清液置于-80℃保存備用。核蛋白使用核蛋白提取試劑盒，按照試劑說明書上的步驟進行提取。SDS-PAGE電泳、轉膜并采用特異性抗體進行Western blot分析。一抗：Nrf2（1∶200）、β-actin（1∶1 000）、Lamin A（1∶1 000）；二抗：堿性磷酸酶標記的抗兔IgG（1∶1 000）、抗小鼠IgG （1∶1 000）。采用凝膠成像分析系統分析和計算蛋白的灰度值，以目的條帶與內參β-actin、Lamin A的平均灰度值的比值表示蛋白水平，進行半定量分析。

1.2.5實時定量逆轉錄PCR檢測mRNA含量：Trizol法提取細胞總mRNA，按逆轉錄試劑盒說明書進行RNA逆轉錄反應合成cDNA。然后以β-actin為內參照進行實時熒光定量PCR。所用引物序列：CAT，5′-TGAGAAGCCTAAGAACGCAATTC-3′和5′-CCC TTCGCAGCCATGTG-3′；SRX，5′-GCTTCCTCTCGG GAGTCCTT-3′和5′-CAGCAACAGCGACTACGAAG TAA-3′；β-actin，5′-TGACCCAGATCATGTTTGG-3′和5′-ATCTCTTGCTCGAAGTCCAG-3′。由PCR曲線得到到達閾值時的循環數（cycle threshold，Ct）值，采用2-△△Ct方法進行相對定量的分析。

1.3統計學分析

2　結果

2.1細胞內ROS含量測定結果

與G1組相比，G2組細胞內ROS含量顯著升高（P＜0.05）；與G2組相比，G3、G4組HaCaT細胞內ROS含量明顯降低，并呈劑量依賴性（P＜0.05）。見表1。

2.2細胞增殖活性的測定結果

與G1組相比，G2組HaCaT細胞增殖活性明顯下降（P＜0.05）；與G2組相比，G3、G4組細胞增殖活性明顯提升，并呈劑量依賴性（P＜0.05）。見表1。

2.3Nrf2蛋白表達的測定結果

紫外線輻射24 h后，G2組HaCaT細胞內總的Nrf2以及細胞核內Nrf2蛋白表達明顯高于G1組（P＜0.05），G3、G4組細胞內總的Nrf2及核內Nrf2蛋白表達顯著增多，與G2組相比差異有統計學意義（P＜0.05），且與tBHQ呈劑量依賴關系。見表1、圖1。

2.4 CAT和SRX mRNA的測定結果

與G1組相比，G2組細胞內CAT和SRX mRNA表達增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與G2組相比，G3、G4組CAT和SRX mRNA表達顯著提高（P＜0.05），且隨著tBHQ劑量的增加，CAT和SRX mRNA也隨之增高，呈顯著的劑量—效應關系。見表1。

表1 各組間HaCaT細胞內ROS、細胞增殖活性、細胞內總的和細胞核內Nrf2蛋白、CAT和SRX m RNA的表達Tab.1　Determ ination o f ROS，cell viability，whole-ce ll and nuclear Nrf2，m RNA of CAT and SRX in HaCaT cells of different groups

圖1　各實驗組間HaCaT細胞內和細胞核內Nrf2蛋白的表達Fig.1　Whole-cell and nuc lear Nrf2 protein expressions of HaCaT cells o f different groups

3　討論

自然界的主要紫外線光源是太陽，根據波長可將紫外線劃分為4個波段：紫外線A（波長320～400 nm）、UVB（波長275～320 nm）、紫外線C（波長200～275 nm）、紫外線D（波長為10～200 nm）。其中UVB為中波紫外線，此類紫外線的極大部分被皮膚的表皮層所吸收，表皮中的角質形成細胞是中波紫外線輻射作用的主要靶細胞。近年研究表明［1，2］，中波紫外線輻射可以使角質形成細胞內產生大量ROS，誘發細胞氧化損傷、DNA損傷及細胞凋亡等皮膚損傷，導致皮膚出現紅斑、炎癥、皮膚老化，嚴重者可引起皮膚癌，是應重點預防的紫外線波段。

Nrf2是細胞內氧化損傷反應最重要的核轉錄因子，生理狀態下Nrf2與其胞質抑制蛋白Keap1偶聯錨定在胞質，當細胞受到氧化應激因子刺激下，Nrf2 從Keap1中解離并轉位進入細胞核，與抗氧化反應元件結合，介導其下游抗氧化酶，如SRX、CAT等基因的表達，啟動Nrf2-抗氧化酶途徑，清除細胞內ROS，降低細胞、組織及器官的氧化損傷［3，4］。tBHQ是一種安全高效的抗氧化劑，根據中華人民共和國食品添加劑使用衛生標準規定，可用于食用油脂、油炸食品、干魚制品、餅干、方便面、腌制肉制品等。tBHQ是Nrf2的一種激活劑，能通過穩定細胞質內的Nrf2并促進其轉位到細胞核而發揮抗氧化作用［5，6］。

本研究結果顯示，經UVB輻射后HaCaT細胞內ROS含量明顯升高，增殖活性顯著受到抑制，說明UVB輻射能產生過量的ROS導致HaCaT細胞氧化損傷。我們用25 μmol/L、50 μmol/L tBHQ預處理后，再經UVB輻射，可見HaCaT細胞內ROS含量較單純紫外線輻射組明顯下降，同時亦減輕UVB輻射對細胞增殖活性的影響，并隨tBHQ的劑量增高抑制作用顯著增強，說明tBHQ預處理能夠通過降低ROS含量，抑制UVB對HaCaT細胞的氧化損傷。為進一步探討tBHQ抑制UVB對HaCaT細胞的氧化損傷的機制，本研究檢測了Nrf2-抗氧化酶途徑，結果發現tBHQ預處理可以提高細胞內總的Nrf2的表達，更重要的是Nrf2在細胞核的表達亦隨之增加，說明tBHQ可以促進Nrf2核轉位。另外，與單純紫外線輻射組相比，tBHQ預處理能使細胞內的抗氧化酶如CAT和SRX mRNA水平提高，說明tBHQ促進Nrf2核轉位后隨即激活Nrf2-抗氧化酶途徑。

綜上所述，UVB可誘發HaCaT細胞發生氧化損傷；tBHQ可通過增加HaCaT細胞內Nrf2的蛋白表達，并促進其核轉位，從而激活Nrf2-抗氧化酶（CAT和SRX）通路，降低活性氧自由基水平而抑制USB誘發的氧化損傷。

［1］Salucci S，Burattini S，Curzi D，et al.Antioxidants in the prevention of UVB-induced keratynocyte apoptosis［J］.J Photochem Photobiol B，2014，141（6）：1-9.

［2］W?lfle U，Esser PR，Simon-Haarhaus B，et al.UVB-induced DNA damage，generation of reactive oxygen species，and inflammation are effectively attenuated by the flavonoid luteolin in vitro and in vivo ［J］.Free Radic Biol Med，2011，50（9）：1081-1093.

［3］Zhang DD.Mechanistic studies of the Nrf2-Keap1 signaling pathway ［J］.Drug Metab Rev，2006，38（4）：769-789.

［4］G?gotek A，Skrzydlewska E.The role of transcription factor Nrf2 in skin cells metabolism［J］.Arch Dermatol Res，2015，307（5）：385-396.

［5］Eftekharzadeh B，Maghsoudi N，Khodagholi F.Stabilization of transcription factor Nrf2 by tBHQ prevents oxidative stress-induced amyloid beta formation in NT2N neurons［J］.Biochimie，2010，92（3）：245-253.

［6］Li J，Johnson D，Calkins M，et al.Stabilization of Nrf2 by tBHQ confers protection against oxidative stress-induced cell death in human neural stem cells［J］.Toxicol Sci，2005，83（2）：313-328.

（編輯陳姜）

Tert-butylhydroquinoneProtectsHaCaTCells from UltravioletB-induced OxidativeDamages

GUWei1，MAXian-de2，JINLian-feng3，CHEN Jia-hui4
（1.DepartmentofDermatology，FirstAffiliated Hospitalof LiaoningUniversityof TraditionalChineseMedicine，Shenyang110032，China；2.Biotechnology Laboratory，ExperimentCenter forTeachingand Learning，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shenyang110847，China；3.DepartmentofOrthopedics，FirstAffiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China；4.Department of Dermatology，Shenyang No.7 People's Hospital，Shenyang 110003，China）

ObjectiveTo explore the effect of tert-butylhydroquinone（tBHQ）on ultraviolet B（UVB）-induced oxidative damages in human immortalized keratinocytes（HaCaT），and discuss its mechanism.Methods The cultured HaCaT cells were randomly divided into 4 groups：control group（G1），ultravioletirradiation group（G2），25μmol/L tBHQ pretreatmentbeforeultravioletirradiation group（G3），and 50μmol/L tBHQ pretreatmentbeforeultravioletirradiationgroup（G4）.Thecontentof reactiveoxygen specieswasdetected byDCFH-DAmethod，and thecellproliferationwasevaluatedbyMTT.Western blotwasused tomeasure theprotein expression ofnuclear factor E2-related factor2（Nrf2）in both nuclear factions and whole-cell of HaCaT.The mRNA expressions of CAT and SRX were determined by real-time RT-PCR.Results The content of reactive oxygen species in HaCaT cells was increased，and the cell proliferation rate was decreased significantly after ultraviolet irradiation.The pretreatment of 25 and 50 μmol/L tBHQ can inhibit the UVB-induced oxidative damage in a dose-dependent manner in HaCaT cells.Compared with G2 group，tBHQ pretreatment could dose-dependently increase the level of Nrf2 protein in nuclear factions and whole-cell of HaCaT，and also the mRNA expressions of CAT and SRX.ConclusionUVB irradiation can induce oxidative stress damages of HaCaT cells.tBHQ may inhibit the UVB-induced oxidative damages through enhancing Nrf2 expressions and nuclear translocation，then activating the transcription of the downstream antioxidant enzymesCATand SRX.

tert-butylhydroquinone；ultraviolet B；HaCaT cell；nuclear factor E2-related factor 2；oxidative damage

·論著·

R758.1

A

0258-4646（2016）04-0337-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.04.012

遼寧省教育廳科學研究一般項目（L2014363）

顧煒（1976-），女，副主任醫師，博士研究生.

金連峰，E-mail：2375792245@qq.com

2015-10-30

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