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特丁基對(duì)苯二酚抑制中波紫外線誘發(fā)HaCaT細(xì)胞氧化損傷

2016-10-11 01:35:34顧煒馬賢德金連峰陳家惠

顧煒,馬賢德,金連峰,陳家惠

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科,沈陽 110032;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室,沈陽 110847;3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科,沈陽 110032;4.沈陽市第七人民醫(yī)院皮膚科,沈陽 110003)

·論著·

特丁基對(duì)苯二酚抑制中波紫外線誘發(fā)HaCaT細(xì)胞氧化損傷

顧煒1,馬賢德2,金連峰3,陳家惠4

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科,沈陽 110032;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室,沈陽 110847;3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科,沈陽 110032;4.沈陽市第七人民醫(yī)院皮膚科,沈陽 110003)

目的觀察特丁基對(duì)苯二酚(tBHQ)對(duì)中波紫外線紫外線B(UVB)誘發(fā)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT氧化損傷的影響,并探討其作用機(jī)制。方法將HaCaT細(xì)胞隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組(G1組)、單純紫外線輻射組(G2組)、25 μmol/L tBHQ預(yù)處理+紫外線輻射組(G3組)、50 μmol/L tBHQ預(yù)處理+紫外線輻射組(G4組)。二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯熒光探針法檢測細(xì)胞活性氧自由基含量;四甲基偶氮唑藍(lán)法檢測細(xì)胞增殖活性;Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞核內(nèi)核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)蛋白表達(dá);應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測過氧化氫酶(CAT)和硫氧還蛋白(SRX)的mRNA表達(dá)。結(jié)果與G1組相比,G2組HaCaT細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基含量升高,細(xì)胞存活率下降;G3、G4組細(xì)胞分別經(jīng)25和50 μmol/L tBHQ預(yù)處理后能明顯抑制UVB誘發(fā)HaCaT細(xì)胞氧化損傷,并存在劑量依賴性。與G2組相比,G3、G4組細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞核內(nèi)的Nrf2蛋白水平顯著增加,且細(xì)胞內(nèi)CAT和SRX mRNA表達(dá)均明顯高于G2組。結(jié)論UVB可誘發(fā)HaCaT細(xì)胞發(fā)生氧化損傷;tBHQ可通過增加HaCaT細(xì)胞內(nèi)Nrf2的蛋白表達(dá),并促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位,從而激活Nrf2-抗氧化酶(CAT和SRX)通路,消除活性氧自由基而抑制USB誘發(fā)的氧化損傷。

特丁基對(duì)苯二酚;中波紫外線;HaCaT細(xì)胞;核因子E2相關(guān)因子2;氧化損傷

日光中的中波紫外線紫外線B(ultraviolet B,UVB)可以通過誘發(fā)其靶細(xì)胞表皮中的角質(zhì)形成細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng),而導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)紅斑、炎癥、皮膚老化,甚至皮膚癌的發(fā)生。特丁基對(duì)苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)是一種常見的抗氧化劑,研究表明tBHQ可以通過激活核因子E2相關(guān)因子2 (nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)發(fā)揮其抗氧化作用,但目前關(guān)于tBHQ能否抑制UVB誘發(fā)Ha-CaT細(xì)胞氧化損傷還未見報(bào)道。本研究建立人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT紫外線輻射模型,觀察tBHQ 對(duì)UVB輻射導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞氧化損傷的影響,并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT購自上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司。日光紫外線模擬器SUV-1000購自上海希格瑪高技術(shù)有限公司。tBHQ、四甲基偶氮唑藍(lán)、堿性磷酸酶標(biāo)記的抗兔IgG、抗小鼠IgG、二甲基亞砜,購自美國Sigma公司;二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯熒光素探針、胎牛血清、DMEM、Trizol,購自美國Invitrogen公司;Nrf2、β-actin、Lamin A一抗,購自美國Santa Cruz公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR擴(kuò)增試劑盒,購自美國Applied Biosystem公司;核蛋白提取試劑盒,購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組:HaCaT細(xì)胞株用高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、鏈霉素),在37℃、5%CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。將細(xì)胞隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組(G1組)、單純紫外線輻射24 h組(G2組)、25 μmol/L tBHQ預(yù)處理12 h+紫外線輻射24 h組(G3組);50 μmol/L tBHQ預(yù)處理12 h+紫外線輻射24 h組(G4組),其中G2、G3、G4組的紫外線劑量為60 m J/cm2。

1.2.2二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯熒光探針測定細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)含量:將各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,濃度調(diào)整為1×106/mL,加入終濃度10 μmol/L二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯染液,避光,37℃孵育30 min。用熒光酶標(biāo)儀收集熒光信號(hào)(激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長525 nm)。ROS水平以二氯熒光素?zé)晒鈴?qiáng)度表示。

1.2.3四甲基偶氮唑藍(lán)法檢測細(xì)胞增殖活性:細(xì)胞分組處理后,每孔加入四甲基偶氮唑藍(lán)20 μL(濃度為5 g/L,用PBS配制),繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h,終止培養(yǎng),棄上清,加入150 μL的二甲基亞砜,在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定波長為490 nm處各孔的吸光度,記錄結(jié)果。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達(dá):收集并裂解細(xì)胞,超聲處理,離心,上清液置于-80℃保存?zhèn)溆谩:说鞍资褂煤说鞍滋崛≡噭┖校凑赵噭┱f明書上的步驟進(jìn)行提取。SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜并采用特異性抗體進(jìn)行Western blot分析。一抗:Nrf2(1∶200)、β-actin(1∶1 000)、Lamin A(1∶1 000);二抗:堿性磷酸酶標(biāo)記的抗兔IgG(1∶1 000)、抗小鼠IgG (1∶1 000)。采用凝膠成像分析系統(tǒng)分析和計(jì)算蛋白的灰度值,以目的條帶與內(nèi)參β-actin、Lamin A的平均灰度值的比值表示蛋白水平,進(jìn)行半定量分析。

1.2.5實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測mRNA含量:Trizol法提取細(xì)胞總mRNA,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。然后以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。所用引物序列:CAT,5′-TGAGAAGCCTAAGAACGCAATTC-3′和5′-CCC TTCGCAGCCATGTG-3′;SRX,5′-GCTTCCTCTCGG GAGTCCTT-3′和5′-CAGCAACAGCGACTACGAAG TAA-3′;β-actin,5′-TGACCCAGATCATGTTTGG-3′和5′-ATCTCTTGCTCGAAGTCCAG-3′。由PCR曲線得到到達(dá)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)(cycle threshold,Ct)值,采用2-△△Ct方法進(jìn)行相對(duì)定量的分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞內(nèi)ROS含量測定結(jié)果

與G1組相比,G2組細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著升高(P<0.05);與G2組相比,G3、G4組HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯降低,并呈劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

2.2細(xì)胞增殖活性的測定結(jié)果

與G1組相比,G2組HaCaT細(xì)胞增殖活性明顯下降(P<0.05);與G2組相比,G3、G4組細(xì)胞增殖活性明顯提升,并呈劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

2.3Nrf2蛋白表達(dá)的測定結(jié)果

紫外線輻射24 h后,G2組HaCaT細(xì)胞內(nèi)總的Nrf2以及細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)明顯高于G1組(P<0.05),G3、G4組細(xì)胞內(nèi)總的Nrf2及核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)顯著增多,與G2組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且與tBHQ呈劑量依賴關(guān)系。見表1、圖1。

2.4 CAT和SRX mRNA的測定結(jié)果

與G1組相比,G2組細(xì)胞內(nèi)CAT和SRX mRNA表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與G2組相比,G3、G4組CAT和SRX mRNA表達(dá)顯著提高(P<0.05),且隨著tBHQ劑量的增加,CAT和SRX mRNA也隨之增高,呈顯著的劑量—效應(yīng)關(guān)系。見表1。

表1 各組間HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS、細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞內(nèi)總的和細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白、CAT和SRX m RNA的表達(dá)Tab.1 Determ ination o f ROS,cell viability,whole-ce ll and nuclear Nrf2,m RNA of CAT and SRX in HaCaT cells of different groups

圖1 各實(shí)驗(yàn)組間HaCaT細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá)Fig.1 Whole-cell and nuc lear Nrf2 protein expressions of HaCaT cells o f different groups

3 討論

自然界的主要紫外線光源是太陽,根據(jù)波長可將紫外線劃分為4個(gè)波段:紫外線A(波長320~400 nm)、UVB(波長275~320 nm)、紫外線C(波長200~275 nm)、紫外線D(波長為10~200 nm)。其中UVB為中波紫外線,此類紫外線的極大部分被皮膚的表皮層所吸收,表皮中的角質(zhì)形成細(xì)胞是中波紫外線輻射作用的主要靶細(xì)胞。近年研究表明[1,2],中波紫外線輻射可以使角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS,誘發(fā)細(xì)胞氧化損傷、DNA損傷及細(xì)胞凋亡等皮膚損傷,導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)紅斑、炎癥、皮膚老化,嚴(yán)重者可引起皮膚癌,是應(yīng)重點(diǎn)預(yù)防的紫外線波段。

Nrf2是細(xì)胞內(nèi)氧化損傷反應(yīng)最重要的核轉(zhuǎn)錄因子,生理狀態(tài)下Nrf2與其胞質(zhì)抑制蛋白Keap1偶聯(lián)錨定在胞質(zhì),當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激因子刺激下,Nrf2 從Keap1中解離并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核,與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合,介導(dǎo)其下游抗氧化酶,如SRX、CAT等基因的表達(dá),啟動(dòng)Nrf2-抗氧化酶途徑,清除細(xì)胞內(nèi)ROS,降低細(xì)胞、組織及器官的氧化損傷[3,4]。tBHQ是一種安全高效的抗氧化劑,根據(jù)中華人民共和國食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,可用于食用油脂、油炸食品、干魚制品、餅干、方便面、腌制肉制品等。tBHQ是Nrf2的一種激活劑,能通過穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Nrf2并促進(jìn)其轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核而發(fā)揮抗氧化作用[5,6]。

本研究結(jié)果顯示,經(jīng)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯升高,增殖活性顯著受到抑制,說明UVB輻射能產(chǎn)生過量的ROS導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞氧化損傷。我們用25 μmol/L、50 μmol/L tBHQ預(yù)處理后,再經(jīng)UVB輻射,可見HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS含量較單純紫外線輻射組明顯下降,同時(shí)亦減輕UVB輻射對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響,并隨tBHQ的劑量增高抑制作用顯著增強(qiáng),說明tBHQ預(yù)處理能夠通過降低ROS含量,抑制UVB對(duì)HaCaT細(xì)胞的氧化損傷。為進(jìn)一步探討tBHQ抑制UVB對(duì)HaCaT細(xì)胞的氧化損傷的機(jī)制,本研究檢測了Nrf2-抗氧化酶途徑,結(jié)果發(fā)現(xiàn)tBHQ預(yù)處理可以提高細(xì)胞內(nèi)總的Nrf2的表達(dá),更重要的是Nrf2在細(xì)胞核的表達(dá)亦隨之增加,說明tBHQ可以促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位。另外,與單純紫外線輻射組相比,tBHQ預(yù)處理能使細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶如CAT和SRX mRNA水平提高,說明tBHQ促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位后隨即激活Nrf2-抗氧化酶途徑。

綜上所述,UVB可誘發(fā)HaCaT細(xì)胞發(fā)生氧化損傷;tBHQ可通過增加HaCaT細(xì)胞內(nèi)Nrf2的蛋白表達(dá),并促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位,從而激活Nrf2-抗氧化酶(CAT和SRX)通路,降低活性氧自由基水平而抑制USB誘發(fā)的氧化損傷。

[1]Salucci S,Burattini S,Curzi D,et al.Antioxidants in the prevention of UVB-induced keratynocyte apoptosis[J].J Photochem Photobiol B,2014,141(6):1-9.

[2]W?lfle U,Esser PR,Simon-Haarhaus B,et al.UVB-induced DNA damage,generation of reactive oxygen species,and inflammation are effectively attenuated by the flavonoid luteolin in vitro and in vivo [J].Free Radic Biol Med,2011,50(9):1081-1093.

[3]Zhang DD.Mechanistic studies of the Nrf2-Keap1 signaling pathway [J].Drug Metab Rev,2006,38(4):769-789.

[4]G?gotek A,Skrzydlewska E.The role of transcription factor Nrf2 in skin cells metabolism[J].Arch Dermatol Res,2015,307(5):385-396.

[5]Eftekharzadeh B,Maghsoudi N,Khodagholi F.Stabilization of transcription factor Nrf2 by tBHQ prevents oxidative stress-induced amyloid beta formation in NT2N neurons[J].Biochimie,2010,92(3):245-253.

[6]Li J,Johnson D,Calkins M,et al.Stabilization of Nrf2 by tBHQ confers protection against oxidative stress-induced cell death in human neural stem cells[J].Toxicol Sci,2005,83(2):313-328.

(編輯陳姜)

Tert-butylhydroquinoneProtectsHaCaTCells from UltravioletB-induced OxidativeDamages

GUWei1,MAXian-de2,JINLian-feng3,CHEN Jia-hui4
(1.DepartmentofDermatology,F(xiàn)irstAffiliated Hospitalof LiaoningUniversityof TraditionalChineseMedicine,Shenyang110032,China;2.Biotechnology Laboratory,ExperimentCenter forTeachingand Learning,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110847,China;3.DepartmentofOrthopedics,F(xiàn)irstAffiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China;4.Department of Dermatology,Shenyang No.7 People's Hospital,Shenyang 110003,China)

ObjectiveTo explore the effect of tert-butylhydroquinone(tBHQ)on ultraviolet B(UVB)-induced oxidative damages in human immortalized keratinocytes(HaCaT),and discuss its mechanism.Methods The cultured HaCaT cells were randomly divided into 4 groups:control group(G1),ultravioletirradiation group(G2),25μmol/L tBHQ pretreatmentbeforeultravioletirradiation group(G3),and 50μmol/L tBHQ pretreatmentbeforeultravioletirradiationgroup(G4).Thecontentof reactiveoxygen specieswasdetected byDCFH-DAmethod,and thecellproliferationwasevaluatedbyMTT.Western blotwasused tomeasure theprotein expression ofnuclear factor E2-related factor2(Nrf2)in both nuclear factions and whole-cell of HaCaT.The mRNA expressions of CAT and SRX were determined by real-time RT-PCR.Results The content of reactive oxygen species in HaCaT cells was increased,and the cell proliferation rate was decreased significantly after ultraviolet irradiation.The pretreatment of 25 and 50 μmol/L tBHQ can inhibit the UVB-induced oxidative damage in a dose-dependent manner in HaCaT cells.Compared with G2 group,tBHQ pretreatment could dose-dependently increase the level of Nrf2 protein in nuclear factions and whole-cell of HaCaT,and also the mRNA expressions of CAT and SRX.ConclusionUVB irradiation can induce oxidative stress damages of HaCaT cells.tBHQ may inhibit the UVB-induced oxidative damages through enhancing Nrf2 expressions and nuclear translocation,then activating the transcription of the downstream antioxidant enzymesCATand SRX.

tert-butylhydroquinone;ultraviolet B;HaCaT cell;nuclear factor E2-related factor 2;oxidative damage

·論著·

R758.1

A

0258-4646(2016)04-0337-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.04.012

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目(L2014363)

顧煒(1976-),女,副主任醫(yī)師,博士研究生.

金連峰,E-mail:2375792245@qq.com

2015-10-30

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