特丁基對(duì)苯二酚抑制中波紫外線誘發(fā)HaCaT細(xì)胞氧化損傷

顧煒，馬賢德，金連峰，陳家惠

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110847；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，沈陽 110032；4.沈陽市第七人民醫(yī)院皮膚科，沈陽 110003）

·論著·

特丁基對(duì)苯二酚抑制中波紫外線誘發(fā)HaCaT細(xì)胞氧化損傷

顧煒1，馬賢德2，金連峰3，陳家惠4

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110847；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，沈陽 110032；4.沈陽市第七人民醫(yī)院皮膚科，沈陽 110003）

目的觀察特丁基對(duì)苯二酚（tBHQ）對(duì)中波紫外線紫外線B（UVB）誘發(fā)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT氧化損傷的影響，并探討其作用機(jī)制。方法將HaCaT細(xì)胞隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組（G1組）、單純紫外線輻射組（G2組）、25 μmol/L tBHQ預(yù)處理+紫外線輻射組（G3組）、50 μmol/L tBHQ預(yù)處理+紫外線輻射組（G4組）。二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯熒光探針法檢測細(xì)胞活性氧自由基含量；四甲基偶氮唑藍(lán)法檢測細(xì)胞增殖活性；Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞核內(nèi)核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）蛋白表達(dá)；應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測過氧化氫酶（CAT）和硫氧還蛋白（SRX）的mRNA表達(dá)。結(jié)果與G1組相比，G2組HaCaT細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基含量升高，細(xì)胞存活率下降；G3、G4組細(xì)胞分別經(jīng)25和50 μmol/L tBHQ預(yù)處理后能明顯抑制UVB誘發(fā)HaCaT細(xì)胞氧化損傷，并存在劑量依賴性。與G2組相比，G3、G4組細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞核內(nèi)的Nrf2蛋白水平顯著增加，且細(xì)胞內(nèi)CAT和SRX mRNA表達(dá)均明顯高于G2組。結(jié)論UVB可誘發(fā)HaCaT細(xì)胞發(fā)生氧化損傷；tBHQ可通過增加HaCaT細(xì)胞內(nèi)Nrf2的蛋白表達(dá)，并促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位，從而激活Nrf2-抗氧化酶（CAT和SRX）通路，消除活性氧自由基而抑制USB誘發(fā)的氧化損傷。

特丁基對(duì)苯二酚；中波紫外線；HaCaT細(xì)胞；核因子E2相關(guān)因子2；氧化損傷

日光中的中波紫外線紫外線B（ultraviolet B，UVB）可以通過誘發(fā)其靶細(xì)胞表皮中的角質(zhì)形成細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，而導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)紅斑、炎癥、皮膚老化，甚至皮膚癌的發(fā)生。特丁基對(duì)苯二酚（tert-butylhydroquinone，tBHQ）是一種常見的抗氧化劑，研究表明tBHQ可以通過激活核因子E2相關(guān)因子2 （nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）發(fā)揮其抗氧化作用，但目前關(guān)于tBHQ能否抑制UVB誘發(fā)Ha-CaT細(xì)胞氧化損傷還未見報(bào)道。本研究建立人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT紫外線輻射模型，觀察tBHQ 對(duì)UVB輻射導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞氧化損傷的影響，并探討其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT購自上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司。日光紫外線模擬器SUV-1000購自上海希格瑪高技術(shù)有限公司。tBHQ、四甲基偶氮唑藍(lán)、堿性磷酸酶標(biāo)記的抗兔IgG、抗小鼠IgG、二甲基亞砜，購自美國Sigma公司；二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯熒光素探針、胎牛血清、DMEM、Trizol，購自美國Invitrogen公司；Nrf2、β-actin、Lamin A一抗，購自美國Santa Cruz公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR擴(kuò)增試劑盒，購自美國Applied Biosystem公司；核蛋白提取試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組：HaCaT細(xì)胞株用高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、鏈霉素），在37℃、5%CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組（G1組）、單純紫外線輻射24 h組（G2組）、25 μmol/L tBHQ預(yù)處理12 h+紫外線輻射24 h組（G3組）；50 μmol/L tBHQ預(yù)處理12 h+紫外線輻射24 h組（G4組），其中G2、G3、G4組的紫外線劑量為60 m J/cm2。

1.2.2二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯熒光探針測定細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）含量：將各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，濃度調(diào)整為1×106/mL，加入終濃度10 μmol/L二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯染液，避光，37℃孵育30 min。用熒光酶標(biāo)儀收集熒光信號(hào)（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm）。ROS水平以二氯熒光素?zé)晒鈴?qiáng)度表示。

1.2.3四甲基偶氮唑藍(lán)法檢測細(xì)胞增殖活性：細(xì)胞分組處理后，每孔加入四甲基偶氮唑藍(lán)20 μL（濃度為5 g/L，用PBS配制），繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，棄上清，加入150 μL的二甲基亞砜，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定波長為490 nm處各孔的吸光度，記錄結(jié)果。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達(dá)：收集并裂解細(xì)胞，超聲處理，離心，上清液置于-80℃保存?zhèn)溆谩：说鞍资褂煤说鞍滋崛≡噭┖校凑赵噭┱f明書上的步驟進(jìn)行提取。SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜并采用特異性抗體進(jìn)行Western blot分析。一抗：Nrf2（1∶200）、β-actin（1∶1 000）、Lamin A（1∶1 000）；二抗：堿性磷酸酶標(biāo)記的抗兔IgG（1∶1 000）、抗小鼠IgG （1∶1 000）。采用凝膠成像分析系統(tǒng)分析和計(jì)算蛋白的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參β-actin、Lamin A的平均灰度值的比值表示蛋白水平，進(jìn)行半定量分析。

1.2.5實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測mRNA含量：Trizol法提取細(xì)胞總mRNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。然后以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。所用引物序列：CAT，5′-TGAGAAGCCTAAGAACGCAATTC-3′和5′-CCC TTCGCAGCCATGTG-3′；SRX，5′-GCTTCCTCTCGG GAGTCCTT-3′和5′-CAGCAACAGCGACTACGAAG TAA-3′；β-actin，5′-TGACCCAGATCATGTTTGG-3′和5′-ATCTCTTGCTCGAAGTCCAG-3′。由PCR曲線得到到達(dá)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)（cycle threshold，Ct）值，采用2-△△Ct方法進(jìn)行相對(duì)定量的分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞內(nèi)ROS含量測定結(jié)果

與G1組相比，G2組細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著升高（P＜0.05）；與G2組相比，G3、G4組HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯降低，并呈劑量依賴性（P＜0.05）。見表1。

2.2細(xì)胞增殖活性的測定結(jié)果

與G1組相比，G2組HaCaT細(xì)胞增殖活性明顯下降（P＜0.05）；與G2組相比，G3、G4組細(xì)胞增殖活性明顯提升，并呈劑量依賴性（P＜0.05）。見表1。

2.3Nrf2蛋白表達(dá)的測定結(jié)果

紫外線輻射24 h后，G2組HaCaT細(xì)胞內(nèi)總的Nrf2以及細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)明顯高于G1組（P＜0.05），G3、G4組細(xì)胞內(nèi)總的Nrf2及核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)顯著增多，與G2組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且與tBHQ呈劑量依賴關(guān)系。見表1、圖1。

2.4 CAT和SRX mRNA的測定結(jié)果

與G1組相比，G2組細(xì)胞內(nèi)CAT和SRX mRNA表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與G2組相比，G3、G4組CAT和SRX mRNA表達(dá)顯著提高（P＜0.05），且隨著tBHQ劑量的增加，CAT和SRX mRNA也隨之增高，呈顯著的劑量—效應(yīng)關(guān)系。見表1。

表1 各組間HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS、細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞內(nèi)總的和細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白、CAT和SRX m RNA的表達(dá)Tab.1　Determ ination o f ROS，cell viability，whole-ce ll and nuclear Nrf2，m RNA of CAT and SRX in HaCaT cells of different groups

圖1　各實(shí)驗(yàn)組間HaCaT細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá)Fig.1　Whole-cell and nuc lear Nrf2 protein expressions of HaCaT cells o f different groups

3　討論

自然界的主要紫外線光源是太陽，根據(jù)波長可將紫外線劃分為4個(gè)波段：紫外線A（波長320～400 nm）、UVB（波長275～320 nm）、紫外線C（波長200～275 nm）、紫外線D（波長為10～200 nm）。其中UVB為中波紫外線，此類紫外線的極大部分被皮膚的表皮層所吸收，表皮中的角質(zhì)形成細(xì)胞是中波紫外線輻射作用的主要靶細(xì)胞。近年研究表明［1，2］，中波紫外線輻射可以使角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，誘發(fā)細(xì)胞氧化損傷、DNA損傷及細(xì)胞凋亡等皮膚損傷，導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)紅斑、炎癥、皮膚老化，嚴(yán)重者可引起皮膚癌，是應(yīng)重點(diǎn)預(yù)防的紫外線波段。

Nrf2是細(xì)胞內(nèi)氧化損傷反應(yīng)最重要的核轉(zhuǎn)錄因子，生理狀態(tài)下Nrf2與其胞質(zhì)抑制蛋白Keap1偶聯(lián)錨定在胞質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激因子刺激下，Nrf2 從Keap1中解離并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，介導(dǎo)其下游抗氧化酶，如SRX、CAT等基因的表達(dá)，啟動(dòng)Nrf2-抗氧化酶途徑，清除細(xì)胞內(nèi)ROS，降低細(xì)胞、組織及器官的氧化損傷［3，4］。tBHQ是一種安全高效的抗氧化劑，根據(jù)中華人民共和國食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，可用于食用油脂、油炸食品、干魚制品、餅干、方便面、腌制肉制品等。tBHQ是Nrf2的一種激活劑，能通過穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Nrf2并促進(jìn)其轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核而發(fā)揮抗氧化作用［5，6］。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯升高，增殖活性顯著受到抑制，說明UVB輻射能產(chǎn)生過量的ROS導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞氧化損傷。我們用25 μmol/L、50 μmol/L tBHQ預(yù)處理后，再經(jīng)UVB輻射，可見HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS含量較單純紫外線輻射組明顯下降，同時(shí)亦減輕UVB輻射對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響，并隨tBHQ的劑量增高抑制作用顯著增強(qiáng)，說明tBHQ預(yù)處理能夠通過降低ROS含量，抑制UVB對(duì)HaCaT細(xì)胞的氧化損傷。為進(jìn)一步探討tBHQ抑制UVB對(duì)HaCaT細(xì)胞的氧化損傷的機(jī)制，本研究檢測了Nrf2-抗氧化酶途徑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)tBHQ預(yù)處理可以提高細(xì)胞內(nèi)總的Nrf2的表達(dá)，更重要的是Nrf2在細(xì)胞核的表達(dá)亦隨之增加，說明tBHQ可以促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位。另外，與單純紫外線輻射組相比，tBHQ預(yù)處理能使細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶如CAT和SRX mRNA水平提高，說明tBHQ促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位后隨即激活Nrf2-抗氧化酶途徑。

綜上所述，UVB可誘發(fā)HaCaT細(xì)胞發(fā)生氧化損傷；tBHQ可通過增加HaCaT細(xì)胞內(nèi)Nrf2的蛋白表達(dá)，并促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位，從而激活Nrf2-抗氧化酶（CAT和SRX）通路，降低活性氧自由基水平而抑制USB誘發(fā)的氧化損傷。

［1］Salucci S，Burattini S，Curzi D，et al.Antioxidants in the prevention of UVB-induced keratynocyte apoptosis［J］.J Photochem Photobiol B，2014，141（6）：1-9.

［2］W?lfle U，Esser PR，Simon-Haarhaus B，et al.UVB-induced DNA damage，generation of reactive oxygen species，and inflammation are effectively attenuated by the flavonoid luteolin in vitro and in vivo ［J］.Free Radic Biol Med，2011，50（9）：1081-1093.

［3］Zhang DD.Mechanistic studies of the Nrf2-Keap1 signaling pathway ［J］.Drug Metab Rev，2006，38（4）：769-789.

［4］G?gotek A，Skrzydlewska E.The role of transcription factor Nrf2 in skin cells metabolism［J］.Arch Dermatol Res，2015，307（5）：385-396.

［5］Eftekharzadeh B，Maghsoudi N，Khodagholi F.Stabilization of transcription factor Nrf2 by tBHQ prevents oxidative stress-induced amyloid beta formation in NT2N neurons［J］.Biochimie，2010，92（3）：245-253.

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（編輯陳姜）

Tert-butylhydroquinoneProtectsHaCaTCells from UltravioletB-induced OxidativeDamages

GUWei1，MAXian-de2，JINLian-feng3，CHEN Jia-hui4
（1.DepartmentofDermatology，F(xiàn)irstAffiliated Hospitalof LiaoningUniversityof TraditionalChineseMedicine，Shenyang110032，China；2.Biotechnology Laboratory，ExperimentCenter forTeachingand Learning，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shenyang110847，China；3.DepartmentofOrthopedics，F(xiàn)irstAffiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China；4.Department of Dermatology，Shenyang No.7 People's Hospital，Shenyang 110003，China）

ObjectiveTo explore the effect of tert-butylhydroquinone（tBHQ）on ultraviolet B（UVB）-induced oxidative damages in human immortalized keratinocytes（HaCaT），and discuss its mechanism.Methods The cultured HaCaT cells were randomly divided into 4 groups：control group（G1），ultravioletirradiation group（G2），25μmol/L tBHQ pretreatmentbeforeultravioletirradiation group（G3），and 50μmol/L tBHQ pretreatmentbeforeultravioletirradiationgroup（G4）.Thecontentof reactiveoxygen specieswasdetected byDCFH-DAmethod，and thecellproliferationwasevaluatedbyMTT.Western blotwasused tomeasure theprotein expression ofnuclear factor E2-related factor2（Nrf2）in both nuclear factions and whole-cell of HaCaT.The mRNA expressions of CAT and SRX were determined by real-time RT-PCR.Results The content of reactive oxygen species in HaCaT cells was increased，and the cell proliferation rate was decreased significantly after ultraviolet irradiation.The pretreatment of 25 and 50 μmol/L tBHQ can inhibit the UVB-induced oxidative damage in a dose-dependent manner in HaCaT cells.Compared with G2 group，tBHQ pretreatment could dose-dependently increase the level of Nrf2 protein in nuclear factions and whole-cell of HaCaT，and also the mRNA expressions of CAT and SRX.ConclusionUVB irradiation can induce oxidative stress damages of HaCaT cells.tBHQ may inhibit the UVB-induced oxidative damages through enhancing Nrf2 expressions and nuclear translocation，then activating the transcription of the downstream antioxidant enzymesCATand SRX.

tert-butylhydroquinone；ultraviolet B；HaCaT cell；nuclear factor E2-related factor 2；oxidative damage

·論著·

R758.1

A

0258-4646（2016）04-0337-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.04.012

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（L2014363）

顧煒（1976-），女，副主任醫(yī)師，博士研究生.

金連峰，E-mail：2375792245@qq.com

2015-10-30

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