高壓氧誘導神經(jīng)病理性疼痛大鼠自噬的作用

韓光，李璐，趙平

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院麻醉科，沈陽 110004）

·論著·

高壓氧誘導神經(jīng)病理性疼痛大鼠自噬的作用

韓光，李璐，趙平

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院麻醉科，沈陽 110004）

目的探討高壓氧能否誘導自噬產(chǎn)生抗神經(jīng)病理性疼痛作用，從一個全新的角度驗證高壓氧鎮(zhèn)痛的有效性。方法選取60只雄性SD大鼠，隨機均分為4組：對照組（C組）、假手術(shù)組（S組）、坐骨神經(jīng)慢性縮窄組（CCI組）和高壓氧組（HBO組）。在大鼠術(shù)后7 d取脊髓標本，采用Western blot方法檢測微管相關(guān)輕鏈蛋白1輕鏈3Ⅱ（LC3Ⅱ）及泛素結(jié)合蛋白P62表達，在電鏡下觀察各組大鼠脊髓線粒體自噬的變化情況。結(jié)果Western blot顯示CCI組、HBO組大鼠脊髓中LC3Ⅱ及P62含量較C組、S組增加（P＜0.05），而C組與S組之間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。HBO組LC3Ⅱ表達較CCI組增加（P＜0.05），而CCI組P62表達比HBO組顯著增加（P＜0.05）。電鏡下，與C組、S組比較，CCI組、HBO組脊髓小膠質(zhì)細胞的自噬明顯增高（P＜0.05），且C組與S組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論高壓氧能誘導自噬，從而產(chǎn)生抗神經(jīng)病理性疼痛作用。

高壓氧；慢性結(jié)扎；坐骨神經(jīng)；p62；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；線粒體；自噬

自噬是真核細胞進化過程中一種保守的細胞行為，在維持細胞穩(wěn)態(tài)方面占有極其重要的地位。近年來，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤及多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變（腦缺血、脊髓外傷等）自噬細胞產(chǎn)生增多，并對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮保護作用。然而目前自噬對神經(jīng)性病理性疼痛作用報道很少。最近有研究［1］發(fā)現(xiàn)自噬可能與神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)，認為疼痛的發(fā)生、發(fā)展均由于自噬調(diào)節(jié)失衡所致。然而自噬究竟在神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮著什么作用，高壓氧能否誘導其產(chǎn)生尚不清楚，本研究擬通過觀察脊髓小膠質(zhì)細胞的自噬來探討高壓氧抗神經(jīng)病理性疼痛的作用。

1　材料與方法

1.1一般資料

雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量280～350 g，由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心提供。隨機均分成4組：對照組（C組，不進行操作）、假手術(shù)組（S組，暴露坐骨神經(jīng)但不結(jié)扎）、坐骨神經(jīng)慢性縮窄組（CCI組，單側(cè)坐骨神經(jīng)結(jié)扎）、高壓氧組［HBO組，慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎（chronic constriction injury of the sciatic nerve，CCI），術(shù)后連續(xù)進行高壓氧治療5 d］。

1.2方法

1.2.1CCI模型的制備：大鼠腹腔麻醉后，在右側(cè)股骨后分離坐骨神經(jīng)，用絲線做3個松弛結(jié)扎，使神經(jīng)外膜稍有壓力。成功標準：右后腿肌肉出現(xiàn)短陣收縮。縫合皮膚后回籠觀察。S組大鼠僅暴露但不結(jié)扎。

1.2.2大鼠的高壓氧處理：HBO組大鼠連續(xù)5 d進入高壓氧艙內(nèi)行高壓氧治療，進艙后艙內(nèi)的氧濃度為90%以上，壓力為0.25 MPa，以勻速增加或減少壓力。其他組大鼠也放在艙內(nèi)，除高壓氧的壓力、O2濃度不同（壓力為標準常壓，氧濃度為正常21%）外，其他條件均相同。

1.2.3取材：腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）麻醉，行升主動脈插管，灌注0.9%的生理鹽水，使流出液為清涼無色液體，保留大鼠L4～L6脊髓，一部分放在-80℃冰箱保存，剩下的浸泡在4%多聚甲醛中待用。

1.2.4Western blot方法測定組織中微管相關(guān)蛋白1輕鏈 3Ⅱ（microtubulerassociated protein 1 light chain 3Ⅱ，LC3Ⅱ）及泛素結(jié)合蛋白P62表達：用SDSPAGE凝膠試劑盒和ECL發(fā)光法試劑盒制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、顯色，成像拍照，所有條帶用Image J分析結(jié)果，記錄每條蛋白電泳帶的光密度值。LC3Ⅱ及P62與內(nèi)參之比計為各自蛋白表達量。

1.2.5電子顯微鏡觀察自噬體含量：新鮮標本用4%多聚甲醛固定4 h，常規(guī)固定、脫水、浸蠟、包埋制作石蠟切片，制作半薄切片。再甲苯胺藍染色，制作超薄切片。飽和的醋酸鈾-檸檬酸鉛將切片行雙重染色，自然干燥。透射電鏡下觀察組織超微結(jié)構(gòu)，各組每只大鼠取10個視野，記錄自噬體的數(shù)量。

1.3統(tǒng)計學方法

2　結(jié)果

2.14組大鼠脊髓LC3Ⅱ及P62的蛋白表達比較

結(jié)果顯示：CCI、HBO組的大鼠脊髓LC3Ⅱ及P62的表達含量較C組、S組增加（P＜0.05），而C組與S組之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。HBO組的

LC3Ⅱ表達較CCI組增加（P＜0.05），而CCI組的P62表達比HBO組增加（P＜0.05）。見表1、圖1。

2.24組大鼠電鏡下脊髓小膠質(zhì)細胞自噬情況比較

電子顯微鏡下觀察大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞發(fā)現(xiàn)，C組、S組、CCI組、HBO組自噬體數(shù)目分別為0.008、0.009、0.045、0.059/μm2。與C組、S組比較，CCI組、HBO組的線粒體自噬體數(shù)目明顯增高（P＜0.05），而C組與S組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見圖2。

3　討論

神經(jīng)病理性疼痛本身是一種慢性缺血缺氧損傷，細胞遭受低氧刺激時，線粒體電子傳遞鏈中最終受體的氧分子供應(yīng)不足，對細胞大分子和細胞器造成損傷，最終導致細胞功能紊亂或細胞死亡。氧化應(yīng)激反應(yīng)是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病的重要機制，在這一過程中，細胞自噬參與多種炎性介質(zhì)基因編碼，促進疼痛相關(guān)細胞的增殖，對疼痛發(fā)揮著重要的作用［2］。自噬在維持細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、代謝和細胞功能的自身穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要的作用。在生理狀態(tài)下它處于較低水平，當機體受到應(yīng)激刺激（如創(chuàng)傷、缺血缺氧等）自噬會被激活［3，4］。LC3是細胞中酵母基因的同源物，當自噬發(fā)生時LC3隨之增加，亞型LC3Ⅱ含量與自噬體數(shù)量成正比，因此LC3Ⅱ成為檢測自噬體的一個特異性標記物［5，6］。另外，由于P62通過與LC3結(jié)合轉(zhuǎn)入自噬體，被自噬溶酶體降解，P62的蓄積增高常提示自噬受到抑制［7］。

表1　4組大鼠脊髓LC3ⅡP62蛋白表達比較Tab.1　Com parison of LC3Ⅱ and P62 protein expression inspinal cord o f rats in each g roup

圖1　4組大鼠LC3Ⅱ及P62的蛋白表達比較Fig.1　The protein exp ression of LC3Ⅱand P62 in each groupdeterm ined by Western blot

圖2　電鏡下各組小膠質(zhì)細胞形態(tài)×5 000Fig.2　The m orphology of m icroglia in each group under electron m ic roscopy

高壓氧作為一種有效無創(chuàng)的治療手段增加脊髓的氧分壓，提高抗氧化酶活性，緩解疼痛并減少不良反應(yīng)［8］。Yan等［9］已將高壓氧廣泛應(yīng)用于脊髓缺血耐受等領(lǐng)域。前期研究［10］已通過疼痛行為學評分證明了高壓氧對神經(jīng)病理性疼痛治療的有效性，并證實它可減少坐骨神經(jīng)慢性縮窄大鼠脊髓中iNOS、nNOS及小膠質(zhì)細胞的表達。由于高壓氧能有效清除氧自由基，對抗氧化應(yīng)激的不良反應(yīng)，因此推測高壓氧可能誘導自噬的產(chǎn)生。

本實驗發(fā)現(xiàn)，和CCI組比較，HBO組大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞LC3Ⅱ表達增高，而P62的表達較低，說明HBO組脊髓自噬處于活躍的較高水平，可能是高壓氧的一種保護性效應(yīng)。盡管CCI組自噬不像HBO組那樣處于很高水平，但也誘導自噬產(chǎn)生，可能是脊髓本身受損后的一種應(yīng)激反應(yīng)。有文獻［11］報道自噬將作為一種衡量治療神經(jīng)病理性疼痛方法有效性的一種方式或手段。本結(jié)果顯示自噬主要表達在CCI組及HBO組，且HBO組表達得更明顯。此結(jié)果從自噬角度再次證明高壓氧抗神經(jīng)病理性疼痛的有效性，也為高壓氧抗神經(jīng)病理性疼痛機制研究開辟了一個新思路。但此結(jié)果僅是術(shù)后第7天的對比，很難看出高壓氧對自噬影響的變化趨勢，在后續(xù)研究中還應(yīng)就不同時間進行比較。

綜上所述，在神經(jīng)病理性疼痛的過程中可以產(chǎn)生自噬，隨著疼痛的發(fā)展，高壓氧可以增強這種保護性自噬，并成功誘導自噬體延續(xù)。但具體如何作用于自噬體及其機制還需進一步深入研究。

［1］Feng T，Yin Q，Weng ZL，et al.Rapamycin ameliorates neuropathic pain by activating autophagy and inhibiting interleukin-1β in the rat spinal cord［J］.Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2014，34 （6）：830-837.

［2］Marinelli S，Nazio F，Tinari A，et al.Schwann cell autophagy counteracts the onset and chronification of neuropathic pain［J］.Pain，2014，155（1）：93-107.

［3］Shi G，Shi J，Liu K，et al.Increased miR-195 aggravates neuropathic pain by inhibiting autophagy following peripheral nerve injury［J］. Glia，2013，61（4）：504-512.

［4］Rangaraju S，Verrier JD，Madorsky I，et al.Rapamycin activates autophagy and improves myelination in explant cultures from neuropathic mice［J］.J Neurosci，2010，30（34）：11388-11397.

［5］Zhang E，Yi MH，Ko Y，et al.Expression of LC3 and Beclin 1 in the spinal dorsal horn following spinal nerve ligation-induced neuropathic pain［J］.Brain Res，2013，1519（6）：31-39.

［6］Li X，Lin X，Ma H.Overexpression of LC3 in papillary thyroid carcinomas and lymph node metastases［J］.Acta Chir Belg，2015，115 （5）：356-363.

［7］Hua F，Hu ZW.TRIB3-P62 interaction，diabetes and autophagy ［J］.Oncotarget，2015，6（33）：34061-34062.

［8］Matsunami T，Sato Y，Sato T，et al.Antioxidant status and lipid peroxidation in diabetic rats under hyperbaric oxygen exposure［J］. Physiol Res，2010，59（1）：97-104.

［9］Yan W，F(xiàn)ang Z，Yang Q，et al.SirT1 mediates hyperbaric oxygen preconditioning-induced ischemic tolerance in rat brain［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2013，33（3）：396-406.

［10］Han G，Li L，Meng LX.Effects of hyperbaric oxygen on pain-related behaviors and nitric oxide synthase in a rat model of neuropathic pain［J］.Pain Res Management，2013，18（3）：137-141.

［11］Jung KT，Lim KJ.Autophagy：Can it be a new experimental research method of neuropathic pain？［J］.Korean J Pain，2015，28 （4）：229-230.

（編輯武玉欣）

HyperbaricOxygen Induced Autophagy in Neuropathic Rats

HANGuang，LILu，ZHAOPing
（DepartmentofAnesthesiology，ShengjingHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate whether hyperbaric oxygen（HBO）affected neuropathic pain through autophagy and verify the HBO effect. M ethods A totalof60maleSD ratswereselected for thestudyand randomlydivided into4groups：controlgroup（Cgroup），sham operationgroup （S group），chronic constriction group（CCI group）and hyperbaric oxygen group（HBO group）.LC3Ⅱand P62 were determined by Western blot method and the autophagy was detected by electron microscopy on the 7th day.ResultsCCI and HBO groups were significantly higher than C and S group in Western blot（P＜0.05）.There was no difference between group C and group S（P＞0.05）.The expression of LC3Ⅱin HBO group was significantly higher than that in CCI group（P＜0.05）.And the expression of P62 in CCI group was significantly higher than that in HBO group（P＜0.05）.The autophagy in CCI and HBO group were significantly increased comparing to the C and S groups（P＜0.05）.However，the difference betweengroup Cand Swasnotsignificant（P＞0.05）.ConclusionHyperbaric oxygen therapy can induceautophagy foranti-neuropathic pain.

hyperbaric oxygen；chronic constriction injury；the sciatic nerve；P62；microtubulerassociated protein 1 light chain 3；mitochondria；autophagy

R614

A

0258-4646（2016）04-0349-03

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.04.015

沈陽市科學技術(shù)計劃（F15-199-1-35）

韓光（1978-），女，副教授，碩士.

趙平，E-mail：zhaop@sj-hospital.org

2015-10-12

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