光動力聯(lián)合二氧化碳激光對復發(fā)性尖銳濕疣患者外周血CD4+、CD8+T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞表達的影響

李志鋒　李小靜　李立紅　劉保國.河北工程大學附屬醫(yī)院皮膚科，河北邯鄲　056003；.河北省邯鄲市中心醫(yī)院皮膚科，河北邯鄲　05600

光動力聯(lián)合二氧化碳激光對復發(fā)性尖銳濕疣患者外周血CD4+、CD8+T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞表達的影響

李志鋒1李小靜1李立紅2劉保國1
1.河北工程大學附屬醫(yī)院皮膚科，河北邯鄲056003；2.河北省邯鄲市中心醫(yī)院皮膚科，河北邯鄲056001

目的 探討光動力聯(lián)合二氧化碳激光對復發(fā)性尖銳濕疣患者外周血CD4+、CD8+T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞表達的影響。方法 選取2013年4月～2015年4月在河北工程大學附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）皮膚科門診就診的復發(fā)性尖銳濕疣患者30例作為研究組，同時選取我院同期健康體檢者20名作為健康對照組。研究組給予光動力聯(lián)合激光治療。應用流式細胞儀檢測研究組治療前后及健康對照組外周血中T細胞亞群以及CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的百分比。結(jié)果 研究組治療前CD4+/CD8+比值 （1.19±0.98）明顯低于健康對照組 （1.98± 0.30），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），治療后CD4+/CD8+比值（1.75±0.78）與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。研究組治療前和治療后外周血中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞百分比分別為 （13.92±12.65）%和（8.38±2.79）%，均明顯高于健康對照組［（4.22±4.26）%］，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與治療前比較，治療后CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞百分比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論 復發(fā)性尖銳濕疣患者存在免疫功能異常，處于免疫失衡狀態(tài)。光動力可以調(diào)節(jié)復發(fā)性尖銳濕疣患者失衡的免疫狀態(tài)，以利于皮損消退。

光動力療法；二氧化碳激光治療；復發(fā)性尖銳濕疣；免疫功能

［Abstract］Objective To explore the effect of photodynamic therapy combined with carbon dioxide laser therapy for the expression of CD4+，CD8+T cells and regulatory T cells of peripheral blood in patients with recurrent condyloma acuminatum.Methods Thirty cases of patients with recurrent condyloma acuminatum treated in Outpatient Department of Dermatology，Affiliated Hospital of Hebei Engineering University（“our hospital”for short）from April 2013 to April 2015 were selected as study group，20 healthy controls examined in our hospital at the same time were selected as healthy control group.The study group was given photodynamic therapy combined with carbon dioxide laser therapy. Flow cytometry was used to detect the percentages of T lymphocyte subsets and CD4+CD25+Foxp3+T regulatory cells of peripheral blood in study group before and after treatment and healthy control group.Results The ratio of CD4+/CD8+in study group before treatment（1.19±0.98）was lower than that of healthy control group（1.98±0.30），the difference was statistically significant（P＜0.05），after treatment，the ratio of CD4+/CD8+in study group（1.75±0.78）had no statistically significant difference with healthy control group（P＞0.05）.The percentage of CD4+CD25+Foxp3+T regulatory cells of peripheral blood in study group before and after treatment was（13.92±12.65）%and（8.38±2.79）%respectively，which were all higher than that of healthy control group［（4.22±4.26）%］，the differences were statistically significant（P＜0.05）；compared with before treatment，the percentage of CD4+CD25+Foxp3+T regulatory cells after treatment was decreased，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion The immune function of patients with recurrent condyloma acuminatum is abnormal，which is in a state of imbalance.Photodynamic can adjust the immune unbalance of patients with recurrent condyloma acuminatum，which is helpful for the extinction of skin lesions.

［Key words］Photodynamic therapy；Carbon dioxide laser therapy；Recurrent condyloma acuminatum；Immune function

尖銳濕疣是由人類乳頭狀瘤病毒（HPV）感染所致，該病容易復發(fā)，傳染性強。研究顯示患者的細胞免疫功能可能與尖銳濕疣的復發(fā)有密切的關(guān)系［1］。光動力和二氧化碳激光是目前尖銳濕疣的主要治療手段。許多研究表明光動力治療明顯降低了尖銳濕疣的復發(fā)率［2-4］，可能與光動力能殺滅濕疣周邊潛伏病毒有關(guān)。但光動力對機體細胞免疫功能的影響的研究很少，本研究應用流式細胞儀檢測復發(fā)性尖銳濕疣患者光動力聯(lián)合二氧化碳激光治療前后外周血CD4+、CD8+、CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞百分比，探討復發(fā)性尖銳濕疣患者的免疫功能狀況以及光動力聯(lián)合激光治療后對復發(fā)性尖銳濕疣患者免疫系統(tǒng)的影響。

1　資料與方法

1.1一般資料

入選的30例男性患者均來自河北工程大學附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）2013年4月～2015年4月皮膚性病門診，根據(jù)趙辨主編的《中國臨床皮膚病學》［5］中尖銳濕疣的診斷標準確診。入選標準：①有非婚性接觸史或配偶感染史；②疣體醋酸白實驗陽性；③病理可見明顯的凹空細胞；④近3個月內(nèi)至少復發(fā)1次的男性患者。排除標準：①有皮膚光過敏癥、卟啉病或?qū)策愡^敏者；②梅毒、淋病、支原體及衣原體感染、HIV感染及糖尿病；③近1個月曾使用過免疫調(diào)節(jié)藥物或其他細胞毒性藥物者。對照組為我院同期健康體檢的20名男性志愿者。

1.2方法

材料ALA（5-氨基酮戊酸，商品名艾拉），為上海復旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，規(guī)格為118 mg/瓶。試驗光源：光源為波長635 nm半導體激光器，上海復旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司技術(shù)開發(fā)監(jiān)制。二氧化碳激光：輸出功率為4～50 J/cm2，激光型號 （科英JC100D型），臨床治療時根據(jù)皮損大小選擇適當?shù)妮敵龉β省６趸技す饴?lián)合光動力治療：常規(guī)消毒治療區(qū)域及周圍正常皮膚，2%的利多卡因局部浸潤麻醉，根據(jù)皮損部位、大小及深度調(diào)節(jié)激光輸出功率，治療范圍超過疣體基底的1～2 mm。治療后的創(chuàng)面局部外用莫匹羅星乳膏預防感染。經(jīng)二氧化碳激光治療后7～10 d進行光動力治療，每周1次，連續(xù)治療3次。治療前用生理鹽水將ALA粉稀釋成20%的溶液，然后用滅菌生理鹽水清洗患者外陰，將新鮮配制的20% ALA溶液均勻涂于原皮損處及周圍2 cm范圍，塑料薄膜封包，3 h后波長635 nm的光動力治療儀照射，能量密度為100 J/cm2。

1.3外周血T細胞亞群和調(diào)節(jié)性T細胞測定

應用流式細胞儀檢測復發(fā)性尖銳濕疣患者光動力聯(lián)合二氧化碳激光治療前及3次治療后外周血中CD4+、CD8+細胞的百分比、CD4+/CD8+比值及CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞百分比，并與健康對照組比較。抽取30例研究組患者激光治療前、光動力3次治療后及健康對照組靜脈血4 mL，注入真空采血管中，采用乙二胺四乙酸抗凝，于采集后4 h內(nèi)進行實驗。實驗方法：流式細胞儀檢測：抽取兩組受試者肝素抗凝血100 μL，加入淋巴細胞檢測試劑25 μL，混勻，室溫避光染色20 min；加入2 mL紅細胞裂解液，室溫避光放置10 min；1500 r/min離心5 min棄上清液，加磷酸鹽緩沖液2 mL，混勻，1500 r/min離心5 min棄上清液，加入2%多聚甲醛PBS 500 mL固定，放置4～8℃冰箱待檢測。每管加細胞液100 μL，加入10 μL抗CD4-mAb-PerCP、抗CD8-mAb-PerCP、抗CD4+CD25+Foxp3+mAb-PerCP，室溫避光放置15 min；紅細胞溶解液0.5 μL溶解紅細胞15 min；破膜劑Ⅰ、Ⅱ固定和破膜；PBS 3 mL，1200 r/min離心5 min，棄上清；加細胞因子抗體，每份標本分別加同型對照IgG-FITC；溫室避光放置15 min；加PBS 4 mL，1200 r/min，離心10 min，棄上清；適量PBS重懸細胞上流式細胞儀檢測；每份標本檢測1萬個細胞，在CD4+T淋巴細胞中，根據(jù)陰性對照實驗結(jié)果，以CD25、Foxp3設(shè)門，分析CD4+CD25+Foxp3+細胞占CD4+T淋巴細胞的比例。結(jié)果以陽性細胞百分率（%）表示，并經(jīng)Cell Quest功能軟件進行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析。

1.4統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1研究組治療前后和健康對照組外周血T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果比較

研究組治療前CD4+T細胞百分比明顯低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。研究組治療后CD4+T細胞百分比較治療前明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。研究組治療后CD4+T細胞百分比與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。研究組治療前CD8+T細胞百分比高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。研究組治療后CD8+T細胞百分比較治療前下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。研究組治療后CD8+T細胞百分比與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。研究組治療前CD4+/CD8+比值明顯低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。研究組治療后CD4+/CD8+比值較治療前明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。研究組治療后CD4+/ CD8+比值雖然仍低于健康對照組，但兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1　研究組治療前后和健康對照組外周血T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果比較（%，x±s）

2.2研究組光動力治療前后CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞占CD4+T細胞的百分比結(jié)果

研究組治療前和治療后外周血中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞占CD4+T細胞的百分比分別為（13.92±12.65）%和（8.38±2.79）%，均明顯高于健康對照組［（4.22±4.26）%］，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與治療前相比，研究組治療后CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞占CD4+T細胞的百分比降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3　討論

尖銳濕疣的遷延不愈和頑固難治與機體的細胞免疫和體液免疫功能有關(guān)。細胞免疫在控制HPV的激活、復制以及對治療的反應起著主要的調(diào)節(jié)作用。其中T淋巴細胞亞群在人體抗病毒細胞免疫中起主導作用，而CD4+/CD8+T淋巴細胞比值是用于衡量細胞免疫功能的主要指標［6-8］。正常機體內(nèi)各淋巴細胞亞群和細胞因子相互作用并保持一定的平衡。本研究通過檢測光動力聯(lián)合激光治療復發(fā)性尖銳濕疣患者治療前后T細胞亞群及調(diào)節(jié)性T細胞比例，并與健康志愿者對比，研究復發(fā)性尖銳濕疣患者細胞免疫功能狀態(tài)及光動力聯(lián)合激光對復發(fā)性尖銳濕疣患者細胞免疫功能的影響。

本研究顯示，研究組治療前外周血CD4+T細胞百分比和CD4+/CD8+比值與健康對照組比較均明顯下降，CD8+T細胞百分比明顯高于健康對照組。李嘉彥等［9］研究結(jié)果顯示，尖銳濕疣患者外周血中CD4+T細胞百分比、CD4+/CD8+比值下降，顯著低于健康成人，而CD8+T細胞百分比明顯高于健康成人。與本研究結(jié)果一致。CD4+T細胞亞群根據(jù)細胞因子分泌模式的不同分為兩個亞群，即Th1和Th2細胞。Th1型細胞因子IFN在清除病毒中起著重要的作用。HPV感染機體時出現(xiàn)了Th1優(yōu)勢應答向Th2優(yōu)勢應答轉(zhuǎn)化，IFN因子分泌減少。CD8+T細胞發(fā)揮細胞毒作用，需要Th1細胞因子的協(xié)同，當CD4+/CD8+比值異常時，其輔助作用降低，Tc對病毒感染細胞的細胞毒性活性下降，即出現(xiàn)免疫效應的低下，導致對HPV清除能力下降。目前未見到CD8+T細胞反饋抑制CD4+T細胞的證據(jù)，尖銳濕疣外周血CD4+T細胞較健康人明顯降低的原因不清楚，推測HPV病毒可能通過某種機制抑制Th活化或增殖［10］。CD8+T細胞明顯升高可能與病毒弱抗原的不斷刺激和不斷活化有關(guān)。在乙肝病毒感染時，患者外周血CD4+、CD8+T細胞計數(shù)都是降低的，且病毒越活躍，CD8+T越低。而在尖銳濕疣患者中出現(xiàn)CD4+T降低、CD8+T升高分離的狀態(tài)，其原因有待進一步研究［11］。本研究結(jié)果顯示CD4+T細胞百分比和CD4+/CD8+比值的下降提示尖銳濕疣患者機體存在免疫功能異常。

近年來認為，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性 T細胞（Treg細胞）是一類具有免疫負調(diào)節(jié)作用的T細胞亞群［12］，在疾病的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要的作用，其主要通過細胞間直接接觸和分泌抑制性因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、白細胞介素10（IL-10）等發(fā)揮免疫抑制作用。CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞對維持機體免疫耐受和免疫應答穩(wěn)態(tài)具有非常重要的作用，可以使機體在自身損傷最小的情況下有效地清除抗體或病原體。本研究顯示尖銳濕疣患者治療前Treg細胞百分比明顯高于健康對照組，提示機體受到HPV病毒感染時，體內(nèi)T細胞向Treg分化明顯增強，抑制細胞免疫，使病毒能夠逃避免疫細胞清除。林建華等［13］研究發(fā)現(xiàn)尖銳濕疣患者的外周血中Treg細胞較正常健康對照組顯著增加，而且復發(fā)性尖銳濕疣比初診患者其水平更高。與本研究結(jié)果一致，表明尖銳濕疣患者存在免疫抑制。Zhao等［14］報道清除Treg有利于尖銳濕疣治療，證明Treg參與T細胞對HPV的免疫效應。但目前尚不清楚Treg的增多導致了持續(xù)的病毒感染，亦或是病毒持續(xù)感染誘導的Treg的數(shù)量增多。

光動力作為復發(fā)性尖銳濕疣的一種新型的治療方法，其有效性已被證實［15-17］。本研究發(fā)現(xiàn)復發(fā)性尖銳濕疣患者治療前CD4+T細胞百分比明顯低于健康對照組，而經(jīng)過光動力3次治療后CD4+T細胞水平有了提高，與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。CD4+/CD8+比值可以作為反映機體抗病毒免疫狀態(tài)的重要指標。本研究治療前CD4+/CD8+比值明顯低于健康對照組，經(jīng)光動力治療后CD4+/CD8+比值增高，與治療前比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。治療后CD4+/CD8+比值雖然仍低于健康對照組，但與后者比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。CD4+T細胞百分比和CD4+/CD8+比值增高提示二氧化碳激光聯(lián)合光動力治療后復發(fā)性尖銳濕疣患者機體的免疫失衡狀態(tài)有了改善，增強了對HPV感染的清除能力。此外，本研究發(fā)現(xiàn)研究組光動力治療前外周血中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞占CD4+T細胞的百分比明顯高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明CA患者體內(nèi)T細胞向Treg分化明顯增強，細胞免疫受到抑制。二氧化碳激光聯(lián)合光動力治療后與治療前相比，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的百分比明顯降低，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義，表明二氧化碳激光聯(lián)合光動力治療可有效降低CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的百分比，糾正免疫失衡狀態(tài)。治療后CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的百分比仍高于健康對照組，與后者比較有統(tǒng)計學差異，表明二氧化碳激光聯(lián)合3次光動力治療后尖銳濕疣患者仍存在免疫抑制，為預防復發(fā)可能需要密切隨訪觀察或增加光動力治療次數(shù)。研究表明光動力聯(lián)合二氧化碳激光能有效調(diào)節(jié)細胞免疫功能［18］，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，復發(fā)性尖銳濕疣患者存在明顯的免疫失衡狀態(tài)，而光動力聯(lián)合二氧化碳激光治療可以調(diào)節(jié)復發(fā)性尖銳濕疣患者T細胞亞群的失衡，降低Treg細胞百分比，提高患者的全身免疫功能，值得臨床推廣應用。

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Effect of photodynamic therapy combined with carbon dioxide laser therapy for the expression of CD4+，CD8+T cells and regulatory T cells of peripheral blood in patients with recurrent condyloma acuminatum

LI Zhifeng1LI Xiaojing1LI Lihong2LIU Baoguo1
1.Department of Dermatology，Affiliated Hospital of Hebei Engineering University，Hebei Province，Handan056003，China；2.Department of Dermatology，Handan Central Hospital，Hebei Province，Handan056001，China

R752.5

A

1673-7210（2016）08（b）-0138-04

2016-05-10本文編輯：張瑜杰）

河北省邯鄲市科學技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目（1223108086）。

李志鋒（1978-），男，碩士；研究方向：皮膚病性病及皮膚美容。