大鼠面神經干缺血后面運動核團中嗅覺受體基因的表達*

紀子騰， 陳慧珍， 孫　勇， 李清斌， 卓　洋， 李愛民

(徐州醫學院附屬連云港醫院 神經外科， 江蘇 連云港　222002)

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大鼠面神經干缺血后面運動核團中嗅覺受體基因的表達*

紀子騰， 陳慧珍， 孫勇， 李清斌， 卓洋， 李愛民*

(徐州醫學院附屬連云港醫院 神經外科， 江蘇 連云港222002)

目的： 分析大鼠面神經干缺血缺氧對嗅覺受體(OR)基因表達水平的影響。方法： 手術阻斷大鼠鼓室段的巖動脈復制大鼠單側面神經缺血模型，將手術側作為觀察組，對側作為對照組，分別于術后第1、7及14天取大鼠雙側面運動神經核團，采用基因芯片篩選出觀察組表達量高于對照組3倍以上的OR基因，采用RT-PCR法進行驗證。結果： 基因芯片掃描篩選出觀察組面神經運動核團中表達量高于對照組3倍以上的OR基因為Olr400、Olr358、Olr757、Olr1689及Olr550，術后第1天及第7天，觀察組Olr400、Olr757及Olr358的表達量均顯著高于對照組，Olr550、Olr1689表達量顯著低于對照組(P<0.01)；術后第14天，兩組Olr400、Olr757、Olr358、Olr550及Olr1689表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)；經過RT-PCR法驗證，上述5個OR基因在兩組面神經運動核團的表達水平與基因芯片檢測結果完全一致。結論：OR基因可能參與了面神經損傷的早期修復過程。

面神經損傷； 面神經運動核團； 嗅覺受體基因； 基因芯片； 缺血性損傷； 大鼠，Sprague-Dawley

面神經損傷(facial nerve injury)是神經外科較為常見的疾病之一，可導致損傷區域出現癱瘓癥狀或面癱，多由顱腦創傷或醫源性損傷引起[1-2]。嗅覺受體(Olfactory Receptor, OR)屬于G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptor, GPCR)家族，是一種細胞表面受體[3]。哺乳動物的OR一般在鼻腔內嗅覺上皮神經元表面表達，但有研究發現，OR還在特定的非嗅覺組織中表達，因此認為 OR除氣味識別功能外，可能還存在更多的生物學功能[1]。OR在人的中樞神經系統表達廣泛，人的大腦皮層、丘腦、小腦的浦肯野細胞等部位均有OR表達[4]。但關于OR基因在面神經的表達尚未見報道，本研究通過手術阻斷大鼠鼓室段的巖動脈復制大鼠單側面神經缺血模型，觀察手術前后OR基因表達水平的改變。

1　材料與方法

1.1實驗動物與試劑

18只7～8周齡雄性SD大鼠(徐州醫學院動物中心提供)，體質量260～290 g，飼養于SPF環境下，每日光照12 h，自由飲水。總RNA提取試劑為RNAiso Plus#9109(TAKARA)、RNA試劑為RNeasy micro kit (Cat#74004、 QIAGEN、 GmBH及Germany)和RNase-Free DNase Set (Cat#79254、 QIAGEN、GmBH及 Germany)，OR基因芯片Agilent Whole Rat Genome Oligo Microarray(4×44K,上海伯豪生物科技有限公司)，M-MLV試劑盒(凱基生物，南京)。

1.2方法

1.2.1單側面神經缺血模型的建立及分組SD大鼠適應性喂養1周后，參照文獻[5]復制大鼠單側面神經缺血模型，采用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，常規消毒，沿耳廓外上緣做弧形切口，在顯微鏡下阻斷大鼠鼓室段的巖動脈血流，局部采用生理鹽水沖洗，徹底止血后縫合手術切口。于術后第1、7及14天時分別處死大鼠，取雙側面神經運動核團，以手術側(缺血側)面神經運動核團作為觀察組，以對側作為對照組。

1.2.2OR基因的表達采用基因芯片檢測，使用RNAiso Plus#9109提取面神經運動核團的總RNA，采用RNeasy micro kit和RNase-Free DNase Set純化RNA；應用Agilent Whole Rat Genome Oligo Microarray基因芯片檢測OR基因表達，對芯片進行掃描，所得數據采用GeneSpring Software GX 12.6.1 (Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)軟件分析，篩選出觀察組表達量高于對照組3倍以上的OR基因，分別為Olr400、Olr358、Olr757、Olr1689及Olr550；采用RT-PCR法進行驗證。

1.2.3基因芯片檢測結果的驗證采用RT-PCR法，使用1.2.2提取的總RNA，采用一步法進行RT-PCR擴增，實驗步驟按照試劑盒說明書進行。RT-PCR的引物序列見表1。PCR反應按照各自最適的條件進行擴增，以GAPDH作為內參，檢測OR基因在面神經運動核團中的表達。

表1　OR基因引物序列

1.3統計學方法

2　結果

基因芯片掃描篩選出觀察組面神經運動核團中表達量高于對照組3倍以上的OR基因為Olr400、Olr358、Olr757、Olr1689及Olr550；術后第1天及第7天，觀察組Olr400、Olr757及Olr358的表達量均顯著高于對照組，Olr550、Olr1689表達量顯著低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)；術后第14天，兩組Olr400、Olr757、Olr358、Olr550及Olr1689表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。經過RT-PCR法驗證，上述5個OR基因在2組面神經運動核團的表達水平與基因芯片檢測結果完全一致。見圖2。

注：A為術后第1天，B為術后第7天，C為術后第14天；(1)與對照組比較， P<0.01圖1　基因芯片檢測兩組面神經運動核OR基因表達Fig.1　Gene chip detection of OR gene expression in facial nerve motor nucleus of two groups

注：A為術后第1天，B為術后第7天，C為術后第14天；(1)與對照組比較， P<0.01圖2　RT-PCR驗證OR基因表達Fig.2　The expression of OR gene verified by RT-PCR

3　討論

面神經損傷作為臨床較為常見的神經系統疾病，可顯著影響患者正常生活。神經損傷后伴隨著一系列復雜的修復及代償過程，但機制尚未明確[6]。分析面神經損傷修復過程中基因表達的改變有望為該疾病的診療提供新的思路。OR屬于G蛋白偶聯受體(G-protein coupied receptor)家族，哺乳動物的OR主要分布在鼻腔后上部的嗅覺神經元的嗅纖毛，發揮識別氣味分子的功能。研究發現，OR基因除在人的中樞神經系統表達廣泛外，還存在于哺乳動物的其他組織，如睪丸、前列腺、腸道、心臟、皮膚等[7-8]。目前，人們對于OR在非嗅覺組織中所發揮的功能尚不明確，但其廣泛的生物學功能提示該基因可能具有多重生物學功能。本研究嘗試分析面神經損傷后，OR基因家族在面神經運動核團中的表達改變，以期深入認識OR基因在面神經損傷修復中的作用。

本研究首先建立面神經缺血損傷的大鼠模型，采用單側手術對側對照的比較方式，采用兩種獨立的檢查方法分析面神經損傷后OR基因家族在面神經運動核團中的表達改變?；蛐酒瑨呙韬Y選出觀察組面神經運動核團中表達量高于對照組3倍以上的OR基因為Olr400、Olr358、Olr757、Olr1689及Olr550，術后第1天及第7天，觀察組Olr400、Olr757及Olr358的表達量均顯著高于對照組，Olr550、Olr1689表達量顯著低于對照組(P<0.01)；術后第14天，兩組Olr400、Olr757、Olr358、Olr550及Olr1689表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。經過RT-PCR法驗證，上述5個OR基因在2組面神經運動核團的表達水平與基因芯片檢測結果完全一致。提示OR基因在面神經損傷后2周內可能參與面神經運動核團內的病理生理改變，但其具體發揮的功能及相關機制尚需進一步探索以明確。既往研究顯示大鼠面神經缺血性損傷模型動物在術后2～3周即可出現面神經功能的部分恢復[9]。面神經并不參與嗅覺傳導通路，已有的研究也并未發現面癱大鼠伴有明顯的嗅覺缺失，這些表達差異性的OR基因在面神經中的具體功能還有待蛋白水平上的進一步研究[10]。但這提示OR基因可能參與面神經損傷后的早期神經修復過程，但具體機制不詳。OR基因的多功能性越來越受到關注。研究這些OR具體功能的難點在于目前可使用的特異性的OR抗原較少，它們在非嗅覺組織中所對應的配體也難以確定。在基因水平上，非嗅覺組織表達的OR基因正陸續被發現，但對于這些OR基因的調控方式尚有待研究。OR基因在嗅上皮表達的特點是單個嗅覺神經元在接受氣味信號后僅表達一個OR基因；當一種OR基因開始表達其他的OR基因立即會被沉默[11]。但人們在睪丸和肌肉等組織中發現單一細胞表達多種OR基因的現象，說明這種“One neuron-one receptor”原則在嗅覺系統以外的組織中可能并不適用[12]。深入對OR基因的研究有望給神經損傷修復的治療帶來新的靶點。

綜上，面神經缺血后OR基因在面神經運動核團中發生表達改變，且在術后2周內恢復，提示OR基因可能參與了面神經損傷的早期修復過程。

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(2016-05-25收稿，2016-08-30修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 劉華

Expression of Olfactory Receptors in Facial Motor Nucleus in Rats' Facial Nerve Ischemia

JI Ziteng, CHEN Huizheng, SUN Yong, LI Qingbin, ZHUO Yang, LI Aiming

(DepartmentofNeurosurgery,theLianyungangAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Lianyungang222002,Jiangsu,China)

Objective: To analyze the effect of facial nerve ischemia and hypoxia on expression of olfactory receptors(OR). Methods: The rats model of single side nerve ischemia was established by surgical interruption of rock artery in tympanic segment. The operation side was adopted as observation group and the other side as control group. Bilateral motor nuclei of the rat were taken at the 1st, the 7thand the 14thday after operation, respectively. The gene chip was adopted to scan and screen theORgene whose expression level of observation group was 3 times higher than that of control group, and RT-PCR method was used to verify theORgene. Results: TheORgene whose expression level of observation group was 3 times higher than that of control group in face nerve motor nuclei were Olr400, Olr358, Olr757, Olr1689 and Olr550. At the 1st and the 7th day after operation, the expression level of Olr400, Olr757 and Olr358 in observation was significantly higher than that of control group while the expression level of Olr1689 and Olr550 was significantly lower that that of control group (P<0.01). At the 14thday, there was no statistically significant difference in the expression level of Olr400, Olr358, Olr757 and Olr1689 (P>0.05). RT-PCR result showed that the expression level of the 5ORgene in in face nerve motor nuclei of the two groups was completely consistent with the gene chip detection results. Conclusion:ORgene may be involved in the early repair of facial nerve injury.

facial nerve injury; facial nerve motor nucleus; olfactory receptor; microarray; ischemic injury; rats,Sprague-Dawley

E-mail:liaimin6529@hotmail.com

R741

A

1000-2707(2016)09-1053-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.014

網絡出版時間：2016-09-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.038.html