子宮內膜癌患者外周血調節性T細胞與腫瘤免疫的相關性*

于丹軍， 樊　靜， 劉廣賢， 胡　月， 趙　月， 薛丹鳳， 孫鳳英

(1.秦皇島市第一醫院 檢驗科， 河北 秦皇島　066000； 2.秦皇島市第四醫院 檢驗科， 河北 秦皇島　066000； 3.解放軍307醫院 腫瘤研究所， 北京　100071)

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子宮內膜癌患者外周血調節性T細胞與腫瘤免疫的相關性*

于丹軍1， 樊靜2**， 劉廣賢3， 胡月1， 趙月2， 薛丹鳳2， 孫鳳英2

(1.秦皇島市第一醫院 檢驗科， 河北 秦皇島066000； 2.秦皇島市第四醫院 檢驗科， 河北 秦皇島066000； 3.解放軍307醫院 腫瘤研究所， 北京100071)

目的： 研究子宮內膜癌(EC)患者外周血CD4+CD25+CD127LOW和CD4+CD25+foxp3+調節性T細胞(Treg)的百分比(CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4)與EC患者血清白細胞介素-10(IL-10)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)、TGF-β2水平的相關性，探討CD4+CD25+Treg在腫瘤免疫逃逸中的作用機制。方法： 30例確診的EC患者(EC組)及30例健康體檢女性(對照組)，用流式細胞術分別檢測EC組手術前后和化療后及對照組外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4，同時用ELISA法檢測上述時點2組被檢者血清IL-10、TGF-β1及TGF-β2含量；比較對照組、EC組手術前外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4及血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量，比較EC患者手術前、手術后及化療后外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4 、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4及血清TGF-β1、TGF-β2及IL-10含量，采用spearman相關分析法分析EC患者外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4與手術前血清IL-10、TGF-β1及TGF-β2含量的相關性。結果： 與對照組比較，EC組患者手術前外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4、血清IL-10的含量均明顯升高, TGF-β2含量明顯降低(P<0.01)；與手術前比較，EC組患者手術后及化療后CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4、血清IL-10和TGF-β2含量明顯降低(P<0.01)，手術后血清TGF-β1含量無明顯變化(P>0.05)，而化療后血清TGF-β1含量明顯降低(P<0.01)；EC組患者CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4與血清TGF-β1含量存在正相關(r=0.284,P=0.049)，CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4與血清IL-10含量存在正相關(r=0.287,P=0.047)。結論： EC患者外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg、CD4+CD25+Foxp3+Treg水平上調，可能是腫瘤產生免疫耐受，發生腫瘤免疫逃逸的原因。

子宮內膜腫瘤； 調節性T細胞； 細胞因子； 免疫耐受； 流式細胞術

子宮內膜癌(endometrial carcinoma，EC)是婦科三大惡性腫瘤之一，有研究發現婦科惡性腫瘤的發生、發展與腫瘤免疫逃逸密切相關[1]。CD4+CD25+調節性T細胞(T regulatory cell, Treg)是一種新型的免疫抑制細胞，能維持機體耐受和免疫穩定的狀態，預防自身免疫性疾病，CD4+CD25+Treg能降低腫瘤免疫治療的效果，產生免疫抑制，在腫瘤免疫的逃逸中起到重要作用[2-3]。研究發現，惡性程度越高的EC患者體內CD4+CD25+Treg細胞越多，患者的預后越差[4]。因此，推測外周血中CD4+CD25+Treg可能參與了EC的發生和發展。本研究通過比較EC患者外周血中CD4+CD25+CD127LOWTreg及CD4+CD25+foxp3+Treg在CD4+T淋巴細胞(CD4)中的百分比(CD4+CD25+CD127LOWTreg/ CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/ CD4)及其與血清中轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1， TGF-β1)、TGF-β2和白細胞介素-10(interleukin-10)等細胞因子的相關性，了解CD4+CD25+Treg在EC的發生及發展中的意義。

1　對象與方法

1.1對象、試劑及儀器

選擇2014年8月～2015年8月經病理確診的EC患者30例作為EC組，EC患者確診后均未進行放化療、未行激素或者生物免疫治療，42～75歲，平均(52.3±7.6)歲；中低分化10例，高分化20例；Ⅰ～Ⅱ期18例， Ⅲ～Ⅳ期12例。選擇同時期的健康女性體檢者30例為對照組，33～77歲，平均(50.5±6.7)歲；均未妊娠，排除近期感染和自身免疫性疾病、使用糖皮質激素和非甾體類藥物者。兩組被檢者一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究獲醫院倫理委員會批準，所有被檢者均簽署知情同意書。儀器為Beckman Coulter EP-ICS XL流式細胞儀(購自美國貝克曼公司)，試劑有鼠抗人 FITC-CD4、PE-CD25、PC5-CD127、同型對照鼠抗人IgG(購自美國貝克曼公司)、Foxp3(Forkhead /winged-helix transcription factor box P3 )試劑盒(購自美國ebioscience公司)，IL-10、TGF-β1及TGF-β2試劑盒(購自Rapibio公司)。

1.2方法

1.2.1標本采集EC組于手術前1 d、手術后1個月及化療4個周期后，對照組于體檢時采集靜脈血8 mL，均分3管；兩管用EDTA抗凝，分別測定CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4；第3管不抗凝，靜置分層，收集血清測定IL-10、TGF-β1及TGF-β2水平。1.2.2CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/ CD4檢測采用流式細胞術，取1.2.1項下2管抗凝全血，分別加入鼠抗人FITC-CD4、PE-CD25、PC5-127抗體或PC5-Foxp3抗體及同型對照，避光孵育15 min進行表面染色，固定破膜后加入相應熒光抗體，離心棄上清后上機檢測。

1.2.3IL-10、TGF-β1及TGF-β2的檢測采用ELISA法，取1.2.1項下分離的血清，按照試劑盒說明書的操作步驟檢測IL-10、TGF-β1及TGF-β2含量。

1.3觀察指標

比較對照組與EC組患者手術前外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/ CD4 、CD4+CD25+Foxp3+Treg/ CD4和血清TGF-β1、TGF-β2及IL-10含量，比較EC患者手術前、手術后及化療后外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4、CD4+CD25+Foxp3+/CD4及血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量，采用spearman相關分析法分析EC患者外周血D4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4與手術前血清TGF-β1、TGF-β2及IL-10含量的相關性。

1.4統計學方法

2　結果

2.1外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4、CD4+CD25+Foxp3+/CD4及血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量

與對照組比較，EC組患者手術前外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4、CD4+CD25+Foxp3+/CD4、血清IL-10的含量均明顯升高, TGF-β2含量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；TGF-β1含量雖然升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1，圖1。

表1　對照組與EC組手術前外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4、CD4+CD25+Foxp3+/CD4及血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量

注： A、C為對照組，B、D為EC組圖1　對照組與EC組手術前外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4、CD4+CD25+Foxp3+/CD4Fig.1　The CD25+foxp3+ Treg CD25+CD127LOWTreg accounted for CD4+ T lymphocyte ratio in peripheral blood of two groups

2.2EC患者外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4及血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量

與手術前比較，EC患者手術后及化療后外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4、CD4+CD25+Foxp3+/CD4、血清TGF-β2、IL-10含量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；手術后TGF-β1含量無明顯變化(P>0.05)，化療后明顯降低(P<0.01)。見表2。

表2　EC患者外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4、CD4+CD25+Foxp3+/CD4及血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量

(1)與手術前比較，P<0.01；(2)與手術后比較，P<0.01

2.3EC患者外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4與血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量的相關分析

spearman相關分析結果顯示，EC患者外周血CD4+CD25+CD127LOW/CD4與血清TGF-β1含量存在正相關(r=0.284,P=0.049)，與TGF-β2、IL-10無相關性(r=0.109、0.092,P=0.300、0.266)；CD4+CD25+Foxp3+/CD4與血清IL-10含量存在正相關(r=0.287,P=0.047)，與TGF-β1、TGF-β2無相關性(r=-0.221、-0.097，P=0.101、0.290)。

3　討論

EC占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%，其發病率近年呈上升趨勢，且Ⅳ期患者5年生存率僅為5 %～23 %[5]。目前，以腫瘤免疫治療為代表的腫瘤生物治療已成為繼手術、化療及放療治療腫瘤不可缺的新模式，大量研究提示惡性腫瘤患者的免疫系統在腫瘤局部和全身處于耐受或缺陷狀態，腫瘤在逃逸機體的免疫機制之后才能進一步惡化[6]。Treg是具有顯著免疫抑制作用的CD4+T細胞亞群，對免疫系統功能具有抑制效應，與腫瘤細胞的免疫逃逸與免疫耐受密切相關[7]。Foxp3是叉頭翼狀螺旋轉錄因子的總稱，在Treg細胞上特異性表達，可以促進腫瘤的生長、抑制機體抗腫瘤免疫應答，在Treg的發育和功能上起著重要的作用[8]。Foxp3是CD4+CD25+Treg細胞生長發育和調節功能的重要因子，是研究人類CD4+CD25+Treg細胞最具特異性的細胞分子標志物[9]。CD127是Treg 特異性較高的細胞表面標志物，用CD127篩選的Treg在體外實驗顯示出特有的抑制活性，能區分效應性T細胞[10]。CD127為IL-7的受體α鏈，在Treg細胞表面特異性低表達，與Foxp3表達有很好的相關性，本實驗采用CD4+CD25+CD127LOW與CD4+CD25+Foxp3+兩組抗體共同篩選Treg細胞，結果顯示，EC患者外周血CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4均高于對照組(P<0.01)，說明經過相應治療后，CD4+CD25+Treg數目明顯下降，CD4+CD25+Treg在腫瘤的免疫逃逸中起到了重要的作用。

Treg細胞在腫瘤免疫逃逸中的發揮著重要的作用，分泌抑制性細胞因子如IL-10、轉化生長因子-β(TGF-β)等可誘導腫瘤的T細胞耐受，IL-10具有免疫抑制功能，TGF-β能夠直接抑制CD8+CTLS激活，顯著減弱腫瘤免疫的效果[11-12]。本文中，EC組與對照組血清TGF-β1、TGF-β2、IL-10含量相比較，EC組IL-10含量明顯高于對照組，TGF-β2含量明顯低于對照組(P<0.01)，TGF-β1含量雖有升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；研究還發現EC組手術后和(或)化療后的TGF-β1、TGF-β2和IL-10含量均較手術前明顯下降(P<0.01)，說明EC組織誘導產生的TGF-β和IL-10可能也發揮一部分作用；Mao等[12]研究發現在惡性腫瘤患者中CD4+CD25+Foxp3foxp3+Treg含量明顯增加，有研究也證實，卵巢癌患者Treg細胞數量的增加與卵巢癌的進展程度呈正相關[14-15]。本文相關性分析結果顯示，CD4+CD25+CD127LOWTreg/CD4與 TGF-β1、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4與 IL-10含量之間存在著正相關(P<0.05)，提示血清中TGF-β1、IL-10水平變化可間接反映EC的腫瘤免疫進展情況。

綜上，EC患者體內CD4+CD25+Treg細胞明顯上調，可能參與了腫瘤的免疫逃逸，其機制可能與 IL- 10、TGF-β表達上調有關。進一步研究如何調控EC患者體內Treg的表達水平和血清中TGF-β1、TGF-β2及IL- 10的含量達到精準治療有望為抗腫瘤免疫治療提供新的思路。

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(2016-05-25收稿，2016-08-15修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 趙毅

Correlation of Regulatory T Cells with Tumor Immunology in Peripheral Blood of patients with Endometrial Cancer

YU Danjun1, FAN Jing2, LIU Guangxian3, HU Yue1, ZHAO Yue2, XUE Danfeng2, SUN Fengying2

(1.ClinicalLaboratory,FirstHospitalofQinhuangdaoCity,Qinhuangdao066000,Hebei,China; 2.ClinicalLaboratory,FourthHospitalofQinhuangdaocity,Qinhuangdao066000 ,Hebei,China; 3.InstitudeofTumor, 307LiberationArmyHospital,Beijing100071,China)

Objective: To investigate the relationship between two types of regulatory T cells (CD4+CD25+CD127LOWTreg and CD4+CD25+Foxp3+Treg) expression in peripheral blood of patients with endometrial cancer (EC) and tumor immunity. Methods: 35 patients with EC were selected and 30 healthy female as healthy controls, flow cytometry was used to detect the proportion of CD4+CD25+CD127LOWTreg and CD4+CD25+foxp3+Treg accounted for CD4+T lymphocyte expression in peripheral blood in EC group and healthy controls before and after surgery and chemotherapy; ELASA was used to detect content of IL-10 cytokines, TGF-β1and TGF-β2in serum with the same specimens. Results: The proportion of CD4+CD25+CD127LOWTreg and CD4+CD25+foxp3+Treg accounted for CD4+T lymphocyte in peripheral blood in patients and content of IL-10 in serum with EC group were significantly higher than that in healthy controls (P<0.01); the content of TGF-β1 in serum was no statistically significant different in two groups (P>0.05); The proportion of CD4+CD25+CD127LOWTreg and CD4+CD25+foxp3+Treg accounted for CD4+T lymphocyte in peripheral blood in patients and content of IL-10 and TGF-β2in serum with endometrial cancer group were significantly decreased after surgery and chemotherapy (P<0.01); there was no statistically significant difference in the content of TGF-β1in serum after surgery (P>0.05); the content of TGF-β1in serum were significantly decreased after chemotherapy (P<0.01). There was positive correlation between CD4+CD25+CD127LOWTreg and content of TGF-β1(r=0.284,P=0.049) with EC group; there was positive correlation between CD4+CD25+foxp3+Treg accounted for CD4+T lymphocyte and the content of IL-10 (r=0.287,P=0.047). Conclusion: The levels of regulatory T cells increased obviously in peripheral blood in patients with EC, this may be the reason for tumor immunological tolerance and tumor immune escape.

endometrial neoplasms; regulatory T cells; cytokines; immunological tolerance; flow cytometry

秦皇島市科技局科技支撐計劃項目資助(20141A219)

E-mail:qhdjykfj@126.com

R737.33

A

1000-2707(2016)09-1099-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.027

**

網絡出版時間：2016-09-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.006.html