異氟醚后處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

朱家軍, 劉金東, 王大亮, 王永萬, 徐海龍

(1. 江蘇省灌云縣人民醫(yī)院, 江蘇 灌云, 222200; 2徐州醫(yī)科大學(xué), 江蘇 徐州, 221002)

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異氟醚后處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

朱家軍1, 劉金東2, 王大亮2, 王永萬1, 徐海龍1

(1. 江蘇省灌云縣人民醫(yī)院, 江蘇 灌云, 222200; 2徐州醫(yī)科大學(xué), 江蘇 徐州, 221002)

目的探討異氟醚后處理對(duì)不同年齡大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響。方法將成年健康雄性SD大鼠18只和老年健康雄性SD大鼠18只采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組，對(duì)照組(C組)、缺血再灌注組(I/R組)、異氟醚后處理組(IsoPP組)。建立Langendorff離體心臟灌注模型，C組持續(xù)灌注130 min; I/R組平衡灌注10 min后缺血30 min再灌注90 min; 異氟醚后處理組平衡灌注10 min缺血30 min, 隨后用含有1.5%異氟醚的灌注液灌注15 min, 隨后再灌注75 min。于平衡灌注末、再灌注30 min和90 min時(shí)記錄HR、左室舒張末壓(LVEDP)、左室發(fā)展壓(LVDP)、左心室壓力上升最大速率(+dp/dtmax)和左心室壓力下降最大速率(-dp/dtmax)。灌注結(jié)束后，取心尖部心肌組織1 mm3電鏡下觀察線粒體結(jié)構(gòu)并評(píng)分，剩余心臟組織采用TTC染色法測定心肌梗死面積。結(jié)果在成年鼠中，與I/R組相比，異氟醚后處理組心肌再灌注后的心功能指標(biāo)改善，心肌梗死面積減小，線粒體損傷減輕(P<0.05)；在老年鼠中，與I/R組相比，異氟醚后處理組心肌再灌注后的心功能指標(biāo)、心肌梗死面積以及線粒體損傷程度均無明顯改變(P>0.05)。結(jié)論異氟醚后處理減輕了成年老鼠的心肌再灌注損傷，而未能減輕老年鼠心肌的再灌注損傷。

心肌缺血再灌注; 異氟醚后處理; 線粒體超微結(jié)構(gòu)

冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù)、心肌梗死溶栓治療及心肺復(fù)蘇等均可引起心肌缺血再灌注損傷。老年患者缺血性心血管疾病發(fā)生率較高，更易發(fā)生心肌缺血再灌注損傷。因而，吸入麻醉藥對(duì)此類患者心肌缺血再灌注損傷的影響值得關(guān)注。目前，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，異氟醚后處理可減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷[1-2]，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，但關(guān)于異氟醚后處理心肌保護(hù)作用的研究在老年動(dòng)物模型上少見報(bào)道[3-4]。本研究采用離體心臟灌注模型，觀察比較異氟醚后處理對(duì)成年大鼠和老年大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康成年雄性SD 大鼠18只，3～4月齡，體質(zhì)量220～260 g。健康老年雄性SD 大鼠18只, 18～20月齡，體質(zhì)量450～550 g, 均由濟(jì)寧市魯康動(dòng)物飼料經(jīng)銷中心提供。成年大鼠和老年大鼠各自隨機(jī)分為3 組(n=6)：對(duì)照組(C組)、缺血/再灌注組(I/R組)和異氟烷后處理組(IsoPP組)。

1.2主要試劑和儀器

異氟醚(批號(hào): 217151201, 深圳市瑞沃德生命科技有限公司)、異氟醚揮發(fā)罐(Drager)、K-H 液(mmol/L: NaCl 8, KCl 4.7, KH2PO41.2, MgSO41.2, CaCl22.5, NaHCO325, 葡萄糖11.1, EDTA -2Na 0.125)、2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC; Sigma公司，美國)、壓力傳感器(成都泰盟科技有限公司)、H-600透射式電子顯微鏡(日本日立公司)、LK&V超薄切片機(jī)(瑞典LKB公司)。

1.3制備離體心臟缺血再灌注模型

參照文獻(xiàn)[5]建立Langendorff大鼠離體心臟灌注模型。腹腔注射3%戊巴比妥30 mg/kg麻醉，腹腔注射500 IU/mL肝素抗凝，迅速開胸取出心臟，置入預(yù)充氧的冷K-H液中(0 ℃), 修剪主動(dòng)脈根部組織，游離主動(dòng)脈，經(jīng)主動(dòng)脈逆行插管將心臟懸掛于Langendorff灌注裝置上，以K-H液恒壓灌注, K-H液以95%O2+5%CO2混合氣體飽和并使其溫度和PH值分別維持在(37.0±0.5) ℃和(7.40±0.05)。C組持續(xù)灌注K-H液130 min; I/R組平衡灌注K-H液10 min, 然后全心缺血30 min, 隨后K-H液再灌注90 min; IsoPP組平衡灌注10 min后全心缺血30 min, 然后改用1.5%異氟醚(大鼠1.0MAC)預(yù)充的K-H液灌注15 min, 隨后K-H液再灌注75 min。

1.4血流動(dòng)力學(xué)記錄

心臟左心耳處剪一小口，將連有壓力傳感器(成都泰盟科技有限公司)的乳膠球囊(直徑約3 mm)經(jīng)左心房、二尖瓣置人左心室內(nèi)，球囊內(nèi)注射生理鹽水，使平衡期左室舒張末壓(LVEDP)維持0～10 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。經(jīng)Maclab/4s模數(shù)轉(zhuǎn)換器連接計(jì)算機(jī)，連續(xù)記錄心功能指標(biāo)。分別于平衡灌注末(T1)、再灌注15 min(T2)、90 min(T3)時(shí)記錄HR、LVEDP、左室發(fā)展壓(LVDP)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)。

1.5電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)

各組再灌注末分別取心尖部心肌組織1 mm3, 經(jīng)戊二醛—四氧化鋨固定液雙固定，乙醇梯度脫水，環(huán)氧丙烷置換，環(huán)氧樹脂浸透、包埋，做1～2 pm半超薄切片，美蘭染色后光學(xué)顯微鏡下定位；超薄切片機(jī)進(jìn)行50～70 nm超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，透射式電子顯微鏡下觀察、拍照，電鏡下觀察。按照Flameng等評(píng)分觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)[6], 每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)挑選5個(gè)視野，每個(gè)視野隨機(jī)選4個(gè)線粒體(線粒體觀察總數(shù)為20)進(jìn)行損傷程度分級(jí)。0級(jí)：線粒體超微結(jié)構(gòu)正常，顆粒完好；1級(jí)：線粒體結(jié)構(gòu)基本正常，輕度腫脹，線粒體嵴和基質(zhì)超微結(jié)構(gòu)正常，基質(zhì)顆粒缺失；2級(jí)：線粒體中度腫脹，基質(zhì)顆粒喪失，基質(zhì)透明，線粒體嵴沒有破壞；3級(jí)：線粒體嚴(yán)重腫脹，基質(zhì)顆粒喪失，基質(zhì)均勻透明，線粒體嵴斷裂；4級(jí)：線粒體嚴(yán)重腫脹，基質(zhì)顆粒喪失，線粒體嵴完全斷裂，線粒體膜完整性喪失；分別計(jì)0～4分。

1.6TTC染色法測定心肌梗死面積

取心尖部心肌組織1 mm3后的剩余心臟組織保存于-80 ℃冰箱中，標(biāo)本取齊后取出心臟標(biāo)本，將心臟橫切2 mm薄片4～6片，放入1%TTC磷酸鹽緩沖液中(pH=7.4), 37℃水浴箱中閉光孵育10 min, 存活心肌呈磚紅色，梗死心肌呈灰白色。染色對(duì)比明顯后拍照, Image J軟件計(jì)算心肌梗死區(qū)面積，心肌梗死面積=(心肌梗死面積之和/總面積之和)×100%。

2　結(jié)　果

2.1血流動(dòng)力學(xué)

在成年大鼠中，與C組比較，I/R組和IsoP組在T2、T3時(shí)HR、LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax降低, LVEDP升高(P<0.05); 與I/R組比較, IsoP組T2、T3時(shí)HR、LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax升高, LVEDP降低(P<0.05)，見表1。在老年大鼠中，與C組比較, I/R組和IsoP組在T2、T3時(shí)HR、LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax降低, LVEDP升高(P<0.05); I/R與IsoP組各項(xiàng)數(shù)值沒有顯著差異(P>0.05), 見表2。

表1　成年大鼠各組在T1、T2、T3時(shí)間點(diǎn)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較

與C組相比, *P<0.05; 與IR組相比, #P<0.05。

表2　老年大鼠各組在T1、T2、T3時(shí)間點(diǎn)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較

與C組相比, *P<0.05。

2.2梗死面積

在成年大鼠中，與C組相比, I/R組和IsoP組心肌梗死面積百分比增加(P<0.05)；與I/R相比, IsoP組心肌梗死面積百分比減少(P<0.05)。在老年大鼠中，與C組相比, I/R組和IsoP組心肌梗死面積百分比增加(P<0.05); I/R組與IsoP組心肌梗死面積無顯著差異(P>0.05)。見表3。

表3　成年大鼠和老年大鼠各組線粒體超微結(jié)構(gòu)評(píng)分的比較

成年大鼠中, 與C組相比, *P<0.05, 與IR組相比, #P<0.05; 老年大鼠中, 與C組相比, **P<0.01。

2.3線粒體超微結(jié)構(gòu)電鏡評(píng)分

在成年鼠中，與C組相比, I/R組 和IsoP組線粒體損傷加重(P<0.05)；與IR組相比, IsoP組線粒體損傷減輕(P<0.05)。 在老年鼠中，與C組相比, I/R組 和IsoP組線粒體損傷加重(P<0.05)；與IR組相比, IsoP組線粒體損傷無明顯減輕(P>0.05)。見表3。

3　討　論

與異氟醚預(yù)處理相比，異氟醚后處理在再灌注早期進(jìn)行，無需對(duì)再灌注開始時(shí)間進(jìn)行預(yù)測，因而更具有臨床意義。與在體缺血再灌注模型相比, Langendorff大鼠離體心臟灌注模型的優(yōu)點(diǎn)是可以排除神經(jīng)、內(nèi)分泌等因素對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為客觀。本研究結(jié)果表明，在成年鼠中，異氟醚后處理可以減輕缺血再灌注后的心功能，減輕線粒體損傷，減小心肌梗死面積，而在老年大鼠中，異氟醚后處理的心肌保護(hù)作用不再存在。

線粒體是氧化呼吸、能量生成的重要場所，其結(jié)構(gòu)功能的穩(wěn)定對(duì)維持心肌細(xì)胞活性至關(guān)重要。缺血再灌注過程可使得線粒體內(nèi)活性氧物種生成增加[7], 活性氧的大量生成可造成線粒體膜結(jié)構(gòu)的破壞，進(jìn)而造成心肌細(xì)胞的死亡。此外，缺血再灌注時(shí)，心肌細(xì)胞的缺血、缺氧還會(huì)造成線粒體基質(zhì)鈣離子超載[8], 而線粒體鈣超載引起線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔開放的重要因素。mPTP開放被認(rèn)為是缺血再灌注損傷產(chǎn)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[9]。線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔開放會(huì)引起線粒體腫脹，進(jìn)而引起線粒體膜破裂，造成線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c釋放，啟動(dòng)凋亡信號(hào)，引起心肌細(xì)胞凋亡，線粒體的損傷也會(huì)引起ATP耗竭進(jìn)而引起心肌細(xì)胞壞死[10]。由此可見，心肌線粒體結(jié)構(gòu)的損傷程度與再灌注損傷程度密切相關(guān)。因此本實(shí)驗(yàn)通過電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)來判斷異氟醚后處理對(duì)心肌線粒體的影響。結(jié)果表明，異氟醚后處理可以減輕成年大鼠心肌線粒體的再灌注損傷，但不能對(duì)老年大鼠心肌線粒體發(fā)揮保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)的局限之處在于僅觀察了線粒體的超微結(jié)構(gòu)，而沒有對(duì)線粒體的功能進(jìn)行評(píng)估分析，后續(xù)試驗(yàn)可進(jìn)一步分析異氟醚后處理對(duì)再灌注后線粒體膜電位、ATP生成量等的影響。

綜上所述，本研究表明七氟醚后處理可以減輕成年大鼠心肌缺血再灌注損傷，其機(jī)制與增加線粒體對(duì)損傷性刺激的抵抗作用有關(guān)，而七氟醚后處理未能對(duì)老年大鼠發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

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Effect of isoflurane treatment on myocardial ischemia-reperfusion injury of rats

ZHU Jiajun1, LIU Jindong2, WANG Daliang2, WANG Yongwan1, XU Hailong1

(1.GuanyunCountyPeople′sHospitalofJiangsuProvince,Guanyun,Jiangsu, 222200;2.XuzhouMedicalUniversity,Xuzhou,Jiangsu, 221002 )

ObjectiveTo investigate the isoflurane treatment for myocardial ischemia reperfusion injury of rats at different ages. MethodsA total of 18 healthy male SD rats and 18 healthy male SD rats were randomly divided into control group (group C), ischemia-reperfusion (I/R group), isoflurane after treatment group (IsoPP group). Langendorff isolated heart perfusion model was established, group C was infused for 130 min, I/R group was re-perfused for 10 min and after ischemia for 30 min, reperfusion was carried out for 90 min. Isoflurane treated group was re-perfused for 10 min and in ischemia for 30min, followed by containing 1.5% isoflurane perfusion for 15 min, and reperfusion for 75 min. At the end of balance perfusion, HR, left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP), left ventricular developed pressure (LVDP), left ventricular maximum rate of pressure rise (+dp/dtmax) and left ventricular maximum rate of pressure drop (-dp/dtmax) were recorded after reperfusion for 30 min and 90 min. At the end of infusion, apical myocardial tissue 1 mm3mitochondrial structure was observed by electron microscopy, infarct size was measured using the remaining heart tissue TTC staining. ResultsIn adult mice, compared with I/R group, cardiac function indexes after sevoflurane treatment were improved after myocardial reperfusion, infarct size of mitochondrial damage mitigation was decreased (P<0.05); In older mice, compared with I/R group, the cardiac function after isoflurane myocardial reperfusion, the area and the degree of mitochondrial damage of myocardial infarction in isoflurane after treatment group were not significantly changed (P>0.05). ConclusionIsoflurane after treatment can reduce myocardial reperfusion injury, and failure to reduce reperfusion injury of myocardium in aged rats.

myocardial ischemia and reperfusion; isoflurane aftertreatment; ultrastructural structure of mitochondria

2015-12-16

江蘇省連云港市第五期“521工程”科研項(xiàng)目資助計(jì)劃(2014-62)

劉金東

R 542.2

A

1672-2353(2016)17-004-04

10.7619/jcmp.201617002