山葡萄CBF基因表達載體構建及對擬南芥根生長的影響

王法微董金曄李曉薇劉洋吳學彥王南董園園陳歡李海燕，

（1. 吉林農業大學生物反應器與藥物開發教育部工程研究中心，長春 130118；2. 吉林農業大學生命科學學院，長春 130118）

山葡萄CBF基因表達載體構建及對擬南芥根生長的影響

王法微1董金曄2李曉薇1劉洋2吳學彥2王南1董園園1陳歡2李海燕1，2

（1. 吉林農業大學生物反應器與藥物開發教育部工程研究中心，長春 130118；2. 吉林農業大學生命科學學院，長春 130118）

為了研究山葡萄CBF基因調節植物對鹽脅迫的應答機理，分別構建了山葡萄VaCBF1、VaCBF2和VaCBF3的植物過表達載體。經酶切及瓊脂糖電泳檢測證實3個基因均插入到pBASTA中，表明表達載體構建成功。然后，分別將3個植物過表達載體轉入農桿菌EHA105中，并通過浸花法浸染擬南芥。利用除草劑篩選獲得3個基因的擬南芥過表達株系。最后，對野生型擬南芥與轉基因擬南芥進行鹽脅迫處理，發現OE-CBF2轉基因植株的主根伸長長度顯著長于其它植株，3個轉基因株系的側根長度也明顯長于野生型植株。上述結果表明山葡萄CBF基因可能在植物鹽脅迫中對根部生長發育起到非常重要的調控作用。

山葡萄；CBF基因；表達載體；根生長

Boyer等［1］指出環境問題將成為影響作物產量的一個重要因素。雖然無法精確計算出環境因素對農作物產量影響的具體數值，但可耕地面積的逐漸減少勢必導致糧食作物產量的持續下滑［2，3］。2007年，世界糧農組織統計出目前全球只有3.5%的土地未受到環境因素影響［4］。這為人們敲響了警鐘，在不久的將來糧食問題可能又會成為社會亟待解決的主要問題。為了降低環境因素對糧食產量的影響，選育抗逆性強的優質作物新品種已經成為農業科研工作者的主要目標。農作物新品種選育的方法主要為傳統遺傳育種與基因工程育種。由于基因工程育種具有目的性強，育種周期短，可克服遠緣雜交不親和障礙等優點，該方法已經成為育種的主要手段。而基因工程育種所需要的表達調控元件以及抗逆基因的挖掘成為重中之重。

CBF（C-repeat binding factor，CBF）轉錄因子是AP2/EREBP轉錄因子家族的一個亞家族，它是植物調節逆境脅迫的重要轉錄因子之一［5］。CBF能夠與啟動子中一個5 bp大小的核心片段（CCGAC）相結合，從而調控該基因的轉錄水平［6，7］。CBF基因的表達能夠被多種非生物脅迫以及上游轉錄因子所調控［8-10］。目前，多種植物CBF轉錄因子參與逆境脅迫的分子機制已經被揭示，包括擬南芥［11］、水稻［12］、玉米［13，14］、小麥［15，16］、大豆［17，18］和葡萄［19］等。擬南芥4個CBF基因過表達后均能夠激活下游靶基因的表達，并能夠提高植物的抗寒能力［20］。AtCBF2基因的負調控作用能夠對AtCBF1及AtCBF3起到適當調節下游基因表達強度，從而適度的調節植物對低溫以及相關脅迫的應答［21］。目前，擬南芥CBF基因的信號轉導網路已經十分清楚，大麥與番茄等植物CBF基因在耐鹽等信號轉導中的作用機制也得到了初步證實［22，23］。這些研究成果均說明CBF轉錄因子在調節植物耐寒、耐鹽等非生物脅迫過程中起著重要的調控作用。

本研究以野生山葡萄為材料，在已經成功分離了山葡萄VaCBF1、VaCBF2和VaCBF3的基礎上［24］，分別將3個基因構建到植物過表達載體中，利用浸花法將目的基因轉入擬南芥基因組中，并對野生型擬南芥與轉基因擬南芥進行鹽脅迫處理，以探究其在植物鹽脅迫中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用轉基因植物材料為哥倫比亞野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana col-0）。山葡萄VaCBF1、VaCBF2和VaCBF3基因（GenBank登錄號：DQ51-7296、DQ517297和DQ517298）由本實驗室克隆。農桿菌EHA105和植物表達載體pBASTA由本實驗室保存?？寺≥d體pMD18-T，限制性內切酶、T4連接酶、Ex Taq聚合酶均購自大連寶生物工程有限公司。凝膠回收試劑盒和質粒小提試劑盒購自愛思進生物技術（杭州）有限公司。PCR引物（表1）及基因測序均由北京金唯智生物科技有限公司完成。

表1 山葡萄CBF基因表達載體構建所用引物

1.2 方法

1.2.1 山葡萄CBF基因植物表達載體的構建 分別以VaCBF1、VaCBF2和VaCBF3的克隆載體質粒為模板，利用基因特異性引物進行PCR擴增。將3個PCR產物分別與表達載體pBASTA同時使用EcoR I與Xba I進行雙酶切，回收目的基因與載體大片段后，利用T4 DNA連接酶進行連接，并將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。提取陽性菌液質粒DNA并進行酶切鑒定，將陽性重組質粒分別命名為pB-CBF1、pB-CBF2和 pB-CBF3。將3個重組質粒送交北京金唯智生物科技有限公司進行測序。

1.2.2 表達載體向農桿菌中的轉化 將農桿菌EHA105感受態細胞置于冰上緩慢融化，將重組質粒pB-CBF1、pB-CBF2和 pB-CBF3分別加入感受態細胞中，冰浴30 min。將離心管放置在液氮中冷凍1 min，然后在37℃水浴中溫育5 min。溫育過后，每個離心管中分別加入1 mL無抗生素的YEP培養基，在28℃搖床中振蕩培養2-4 h。將菌液離心濃縮后涂于含有50 mg/L卡那霉素和100 mg/L利福平的固體YEP培養基上，28℃培養2-3 d，挑取單菌落后進行PCR鑒定。

1.2.3 農桿菌介導的浸花法轉化擬南芥 將野生型擬南芥播種于培養缽中，待擬南芥長至抽薹初期時剪掉所有擬南芥的主莖。當周圍的莖抽薹后除去已經開的花準備浸染。同時準備農桿菌菌液，將農桿菌離心沉淀后使用滲透緩沖液（5%蔗糖，0.02% SilwettL-77）將菌液OD600調至0.9-1.0。將擬南芥花序部分倒置于滲透緩沖液中浸泡1-3 min，之后使用保鮮膜密封后黑暗下平放24 h，最后置于培養室中正常培養。待種子成熟時收取種子，以備后續鑒定。

1.2.4 轉基因擬南芥的篩選與單拷貝株系鑒定 將4℃春化2 d后的T0代轉基因擬南芥種子播種于培養缽中，待長至四葉期時噴施1% Basta，每隔1 d噴施1次，共計噴施3次。觀察擬南芥幼苗生長情況，始終保持綠色的為陽性轉基因植株，慢慢枯萎死亡的為非轉基因植株。將陽性轉基因植株移栽至無Basta的培養缽中繼續培養，并收獲T1代轉基因擬南芥種子。將T1代轉基因擬南芥種子播種于含有1% Basta的MS固體培養基中，每個株系播種約100棵。統計各株系死亡率后計算各個轉基因株系是否符合孟德爾遺傳規律的分離比，從而鑒定單拷貝株系。將單拷貝株系移栽后收取T2代擬南芥種子，準備用于根系的生長發育實驗。

1.2.5 轉基因擬南芥的根系發育分析 將WT與VaCBF1、VaCBF2和VaCBF3的T2代轉基因擬南芥種子春化處理2 d，經70%酒精消毒30 min后，點播于MS固體培養基中。培養7 d后，分別將各個株系植株移栽至含有150 mmol/L NaCl的MS固體培養基中進行鹽脅迫處理。處理7 d后觀察各株系表型變化，并分別統計主根伸長長度、側根數以及側根長度。每個實驗3次重復，并利用SPSS軟件分析各組數據差異的顯著性（P＜0.05）。

2 結果

2.1 山葡萄CBF基因植物表達載體的構建

提取表達載體pB-CBF1、pB-CBF2和 pB-CBF3的質粒DNA，利用EcoR I與Xba I進行雙酶切鑒定，結果（圖1）顯示3個質粒各切出一條約756 bp、762 bp與720 bp的特異條帶。這證實山葡萄VaCBF1、VaCBF2和VaCBF1基因已經成功插入到表達載體中。將pB-CBF1、pB-CBF2和 pB-CBF3的質粒DNA測序后證實，載體插入片段與目的基因序列完全一致，未發現有堿基突變。

2.2 表達載體向農桿菌中的轉化

分別挑取轉化后YEP平板上的單菌落，接種于5 mL液體YEP培養基中搖菌。待菌液生長至OD600為0.8左右時各取1 mL菌液作為模板，利用基因特異性引物（表1）進行PCR驗證陽性菌落。PCR結果（圖2）顯示，3種農桿菌中均含有轉化的目的基因，證實VaCBF1、VaCBF2和VaCBF1基因分別成功轉入農桿菌中。

圖1 表達載體酶切驗證

圖2 農桿菌轉化子的PCR鑒定

2.3 轉基因擬南芥的篩選及單拷貝株系鑒定

待T0代轉基因擬南芥生長至四葉期時利用Basta篩選陽性轉基因植株，噴施3次Basta后非轉基因植株死亡，而轉基因植株仍可以繼續生長（圖3-A）。將陽性轉基因植株移栽至正常土壤的營養缽中繼續生長，并收取該株系T1代種子。將T1代轉基因擬南芥進行春化后播種于含有1% Basta的MS固體培養基中進行再次篩選，并計算轉基因植株死亡率（圖3-B）。OE-CBF1、OE-CBF2和OE-CBF3三個轉基因株系的分離比分別為3.26∶1、3.51∶1與2.88∶1，基本符合孟德爾遺傳定律，證實3個轉基因株系為單拷貝株系。

2.4 轉基因擬南芥主根生長發育分析

將WT與3個轉基因株系T2代種子播種于MS固體培養基中生長，待生長至7 d時測量各個株系的主根長度。結果（圖4）顯示，WT與OE-CBF1的主根長度相一致，而OE-CBF2與OE-CBF3的主根長度要顯著短于WT及OE-CBF1。這說明在正常生長情況下，VaCBF2及VaCBF3的過表達在一定程度上對擬南芥主根生長造成了抑制。

2.5 轉基因擬南鹽脅迫下的根系發育分析

將WT與3個轉基因株系T2代種子播種于MS固體培養基中，待生長至7 d后移栽至含有150mmol/L NaCl的MS固體培養基中進行鹽脅迫處理。脅迫處理8 d后觀察各個株系根系的生長狀態，發現OE-CBF2株系的主根長度顯著長于其他3個株系（圖5）。而OE-CBF2在正常生長情況下的主根長度卻顯著短于WT植株（圖4），產生這種現象的原因可能是在鹽脅迫下VaCBF2轉錄因子基因能夠激活一系列鹽應答基因的表達，增強了植物對鹽脅迫的抵抗能力，從而降低了鹽脅迫對主根生長的影響。

圖3 轉基因擬南芥的篩選（A）及單拷貝株系鑒定（B）

圖4 轉基因擬南芥主根生長狀態分析

圖5 鹽脅迫下擬南芥表型（A）及主根伸長分析（B）

另外，在鹽脅迫后，OE-CBF1的側根數量顯著多于其他3個株系（圖6-A）。這說明在鹽脅迫條件下VaCBF1可能對植物側根數起著一定的調控作用。同時，OE-CBF1、OE-CBF2和OE-CBF3三個株系的側根長度均顯著長于WT（圖6-B）。這說明VaCBF1、VaCBF2和VaCBF3在鹽脅迫中對植物側根的伸長均起著重要調控作用。

3 討論

植物在長期的進化過程中，逐漸形成了自身對環境的適應機制，當植物受到外界刺激后能夠通過植物細胞內基因表達變化來實現和調節脅迫應答反應。1997年，Stockinger等［6］在擬南芥中首先發現一個能夠與C重復序列相結合的因子，即CBF轉錄因子，并且命名為AtCBF1。在正常生長條件下，擬南芥3個CBF基因的過表達植株均表現出生長延遲的現象［11］。將玉米ZmCBF3基因轉入水稻中進行過表達，在正常生長條件下也發現轉基因植株的生長情況受到了一定程度的抑制［25］。而本研究結果顯示OE-CBF2與OE-CBF3在正常生長條件下的主根長度均小于野生型植株。產生此現象的原因可能是由于轉錄因子可直接調控多個下游靶基因，從而導致多個基因的過表達。這種多基因過表達可能會增加植物內能源消耗，最終導致植物根系生長發育的延遲。

圖6 鹽脅迫下WT與轉基因擬南芥側根生長狀態分析

當植物處于非正常生長條件時，植物受到脅迫刺激后CBF基因的過表達就會調節下游相關基因的表達從而抵御外界環境的刺激［23，26］。CBF調控的下游靶基因主要有COR15A、RD29A與KIN2等與逆境脅迫密切相關基因，這些靶基因直接調控植物對不同逆境脅迫的應答。在干旱及低溫處理條件下，擬南芥CBF基因過表達植株生存率明顯高于野生型對照［11］。在干旱脅迫下，水稻ZmCBF3的過表達株系也表現出較強的耐旱能力［25］。本研究中將轉基因擬南芥進行鹽脅迫處理，結果發現OE-CBF2的主根伸長長度顯著長于其他植株。而番茄屬的兩個CBF基因（SlCBF1與ShCBF1）在擬南芥中過表達后，在鹽脅迫條件下轉基因植株的根系生長發育明顯優于WT［23，26］。Duan等［27］報道，在鹽脅迫下植物側根的生長處于停滯狀態，直到生長條件恢復正常后才能開始繼續生長發育。而本研究中在鹽處理后OE-CBF1的側根數量明顯多于WT，而且OE-CBF1、OE-CBF2和 OE-CBF3的側根長度均顯著長于WT，表明VaCBF1、VaCBF2和VaCBF3的過表達在一定程度上緩解了鹽脅迫對植物根系生長發育的抑制作用。說明山葡萄CBF基因可能通過調節植物根系發育來調節植物對鹽脅迫的應答。但本研究只局限于植物根部發育的變化，該基因調控植物根系發育的分子機制仍不清楚，還有待于進一步的研究來揭示。

4 結論

本研究通過構建山葡萄VaCBF1、VaCBF2及VaCBF3基因的植物過表達載體，并分別將3個表達載體轉入擬南芥中，獲得3個轉基因株系OE-CBF1、OE-CBF2與OE-CBF3。對野生型擬南芥與轉基因擬南芥進行鹽脅迫處理，發現OE-CBF2轉基因植株的主根伸長長度顯著長于其它植株，3個轉基因株系的側根長度也明顯長于野生型植株。

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（責任編輯馬鑫）

The Construction of Expression Vector of Gene CBF from Vitis amurensis and the Effects of It on the Root Growth of Arabidopsis

WANG Fa-wei1DONG Jin-ye2LI Xiao-wei1LIU Yang2WU Xue-yan2WANG Nan1DONG Yuan-yuan1CHEN Huan2LI Hai-yan1，2
（1. Ministry of Education Engineering Research Center of Bioreactor and Pharmaceutical Development，Jilin Agricultural University，Changchun 130118；2. College of Life Sciences，Jilin Agricultural University，Changchun 130118）

In order to investigate the response mechanism of CBF gene in the regulation of plant to the salt stress， the plant overexpression vectors of VaCBF1， VaCBF2 and VaCBF3 from Vitis amurensis were constructed. The results by restriction enzyme digestion and agarose gel electrophoresis showed that 3 genes were correctly inserted into pBASTA， indicating that the expression vectors were successfully constructed. Then， 3 over-expressed vectors were transformed into Agrobacterimu tumefaciens EHA105， and Arabidopsis thaliana was leached using floral dip method. The transgenic plants of A. thaliana with over-expression of 3 genes were screened by herbicide Basta. Furthermore， wild and transgenic plants were treated with salt stress. The results revealed that the elongation length of primary root of OE-CBF2 transgenic plant was longer than others， and the lateral roots in 3 genes transgenic plants were longer than wild ones. These results indicate that the CBF genes of V. amurensis play the critical regulation role in the root development during salt stress.

Vitis amurensis；CBF gene；expression vector；root growth

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.019

2015-02-28

國家自然科學基金項目（31201144，31271746），吉林省發改委項目（JF2012C002-04），吉林農業大學國家大學生創新創業訓練計劃項目（201410193036）

王法微，男，助理研究員，研究方向：植物分子生物學；E-mail：fw-1980@163.com

李海燕，女，教授，博士生導師，研究方向：植物分子生物學；E-mail：hyli99@163.com