基于酵母表面展示技術的胸苷磷酸化酶全細胞催化劑的構建

王潔 余磊 楊東 李婕 王洪鐘

（清華大學生命科學學院，北京 100084）

基于酵母表面展示技術的胸苷磷酸化酶全細胞催化劑的構建

王潔 余磊 楊東 李婕 王洪鐘

（清華大學生命科學學院，北京 100084）

胸苷磷酸化酶（TP）在核苷類代謝通路中發(fā)揮重要作用，可催化生成多種核苷類似物。構建了TP的酵母表面展示系統(tǒng)作為全細胞催化劑。從大腸桿菌K12菌株中克隆編碼TP的deoA基因，利用酵母表達質粒pKFS構建重組質粒，電擊轉化畢赤酵母GS115菌株。高拷貝陽性轉化子經(jīng)甲醇誘導96 h后，免疫熒光結果顯示TP在酵母細胞表面成功展示。利用β-胸苷為底物，重組酵母細胞作為全細胞催化劑，經(jīng)HPLC檢測，結果表明展示在酵母表面的TP有催化活性，可以催化β-胸苷生成產(chǎn)物胸腺嘧啶。

胸苷磷酸化酶；全細胞催化；畢赤酵母；表面展示

近50年來，核苷類似物被廣泛用于治療病毒感染及腫瘤類疾病，其中已有超過9種抗代謝核苷類抗腫瘤藥物和25種核苷類抗病毒藥物經(jīng)FDA批準上市［1］。核苷類似物是由人工改造天然核苷的糖基或堿基而合成的核苷類衍生物，由于和天然核苷結構相似，在生物體內(nèi)會和天然核苷競爭，通過抑制相關聚合酶與核酸結合等方式干擾核酸的復制合成［2］，達到治療腫瘤類疾病或抑制病毒增殖的目的。

目前核苷類似物的工業(yè)合成方法主要是傳統(tǒng)的化學合成法和生物轉化法?；瘜W合成反應步驟多，反應條件苛刻，產(chǎn)物純度低［3］；而生物轉化法條件溫和，成本低，應用較廣泛。早期的生物轉化法只能用來生產(chǎn)少數(shù)天然核苷；近年采用較多的生物轉化法是酶法合成，通過將參與核苷代謝通路的酶重組轉化到大腸桿菌中進行誘導表達，經(jīng)過酶的純化固定等方式來催化核苷類似物的合成［4］。本課題首次采用了一種新型生物轉化方法，即開發(fā)于20世紀90年代的酵母表面展示法［5］，來研究核苷類似物的生物酶催化。酵母表面展示法無需酶的純化固定，便于遺傳改造。它通過表達不同的錨定蛋白，可以將多種外源蛋白定位在酵母細胞壁上，利用全細胞作為催化劑進行生物催化過程，有可以反復多次利用、成本低的優(yōu)點，已有報道成功利用酵母表面展示技術來展示a-半乳糖苷酶［5］、糖基轉移酶［6］和脂肪酶［7］等酶，該方法也被廣泛應用于生物催化劑、活疫苗、蛋白質文庫篩選和癌癥診斷等領域。

核苷類似物的生物催化法常用的酶包括N-脫氧核糖轉移酶和核苷磷酸化酶。核苷磷酸化酶包括胸苷磷酸化酶（TP）、尿苷磷酸化酶（UP）和嘌呤核苷磷酸化酶（PNP），通過兩步反應可逆地催化核苷（或脫氧核苷）生成核糖-1-磷酸和堿基。本實驗所研究的TP（EC 2.4.2.4）最先由Schwartz于1978年在E. coli K12中克隆純化［8］。哺乳動物來源的TP同時可作為血管生成因子，在腫瘤組織中有過表達現(xiàn)象［9］。本研究旨在通過構建TP的畢赤酵母表面展示系統(tǒng)，并作為全細胞催化劑，催化β-胸苷轉化為胸腺嘧啶的反應。

1 材料與方法

1.1 材料

pKFS質粒和畢赤酵母GS115菌株由華南理工大學的林影教授贈送，E. coli K12菌株由本實驗保存，E. coli DH5α和pMD19-T質粒購自TaKaRa公司。

限制性內(nèi)切酶、T4連接酶和4×蛋白質SDS PAGE上樣緩沖液（40 mmol/L Tris-HCl pH8.0，200 mmol/L DTT，4% SDS，40% Glycerol，0.032% Bromophenol Blue）均購自TaKaRa公司，PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質粒小提試劑盒和DNA trans2K Plus Marker購自TransGen公司，酵母基因組DNA提取試劑盒購自康為世紀，鼠源抗flag單抗、HRP標記的羊抗鼠二抗和Alexa Fluor 488標記的羊抗鼠二抗均購自中杉金橋公司，胸腺嘧啶、β-胸苷（HPLC級）購自大連美侖公司，基因測序和引物合成由睿博興科公司完成。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的構建 實驗所用引物見表1。pKFS質粒由林影教授改造pPIC9K質粒得到，pKFS帶有絮凝素Flo1蛋白的N端絮凝功能結構域（874aa，F(xiàn)lo1p short chain，縮寫為FS）錨定系統(tǒng)［10］。為構建靈活度更高的FS-TP融合蛋白，本研究設計了一段（G4S）3蛋白linker［7，11］，加到正向克隆引物deoA-pKFS-F上，隨后是deoA基因的5'端序列，為保證融合蛋白的完整表達，序列的起始密碼子被移除。為便于檢測外源蛋白，在deoA基因下游加入了編碼flag標簽（氨基酸序列為DYKDDDDK）的核苷酸序列，在設計下游引物時去掉了deoA基因的3'端序列的終止密碼子。

deoA基因PCR產(chǎn)物連到pMD19-T質粒上進行測序。利用Mlu I和Not I內(nèi)切酶雙酶切pMD19-T-deoA和pKFS質粒，將deoA基因插入Flo1基因的下游，所得重組質粒為pKFS-LA，重組質粒轉化到E. coli DH5α中，在氨芐抗性的LB板上涂布培養(yǎng)，利用deoA-pKFS-F1、deoA-pKFS-R1引物進行菌落PCR來篩選陽性克隆。

表1 實驗所用引物

1.2.2 重組質粒轉化GS115和重組轉化子的篩選 制備GS115酵母細胞的感受態(tài)，重組質粒經(jīng)Sal I線性化后，利用電擊儀（Bio-Rad）進行電擊，轉化到GS115酵母細胞。電轉參數(shù)為1.5 kV，2 ms。轉化子涂布到MD板培養(yǎng)6-7 d后，用MD液體培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)皿，洗脫下來的酵母懸液分別涂布到含1 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL G418抗生素的MD平板上，培養(yǎng)5-6 d。挑取不同MD板的陽性單克隆擴大培養(yǎng)后提取基因組，進行基因組PCR鑒定。

1.2.3 胸苷磷酸化酶的誘導表達及免疫熒光檢測 采用兩步法誘導GS115表達外源蛋白。GS115野生菌株和經(jīng)過驗證的酵母轉化子GS115-LA接種到BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD為2-6，離心后分別用BMMY培養(yǎng)基重懸至OD為1左右，取2 mL細胞作為誘導0點4℃保存，之后加入1%的甲醇于20℃、200 r/min進行誘導，培養(yǎng)7 d，每隔24 h取樣。

取培養(yǎng)96 h的1 mL GS115、GS115-LA細胞離心后，用1×PBS（pH7.0）洗3次，然后用含1 mg/mL BSA、2 mL鼠源抗flag單抗的1×PBS在室溫下低速振蕩孵育2 h，孵育結束后用1×PBS洗3次，用含1 mg/mL BSA、1 mL Alexa-Fluor 488標記的羊抗鼠二抗的1×PBS在黑暗環(huán)境下振蕩孵育1 h。1×PBS洗滌3次后，用GE的DeltaVision高分辨率成像系統(tǒng)分別檢測GS115和GS115-LA細胞的熒光。

1.2.4 Western blot檢測胸苷磷酸化酶的誘導表達 準備1 mL樣品，用破壁緩沖液室溫處理30min，離心后加入20 mL 4×蛋白SDS-PAGE上樣buffer和60 mL去離子水重懸，煮沸10 min后離心，取20 mL上清上樣，進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后，用Bio-Rad轉膜儀將蛋白轉移到PVDF膜上。轉膜結束后，PVDF膜用5%奶粉的TBST封閉2 h，隨后加入1 mL單抗（1∶500）室溫孵育2 h，TBST洗3次；膜放入5 mL封閉液，加入1 mL HRP標記的羊抗鼠二抗室溫振蕩孵育1 h，結束后用TBST洗滌3次。用增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒（TIANGEN）對PVDF膜進行顯色。

1.2.5 HPLC檢測胸苷磷酸化酶的催化活性 配制不同濃度β-胸苷和胸腺嘧啶的標準品，分別制定標準曲線，以0.5 mL誘導96 h的GS115-LA細胞作為全細胞催化劑，GS115細胞作為對照，用50 mmol/L PBS（pH7.5）緩沖液配制含30 mmol/L胸苷的10mL反應體系，50℃振蕩2 h，進行催化反應。反應樣品20倍稀釋后用Waters 600E高效液相色譜儀檢測反應結果。檢測條件為：紫外檢測波長254 nm，柱溫25℃，色譜柱 PLATISILTM ODS C18（5 mm，250×0.46 mm），流動相乙腈∶水=10∶90，進樣量10 mL，流速1 mL/min。

2 結果

2.1 deoA基因重組質粒的構建及高拷貝轉化子的篩選

編碼TP的deoA 基因（EU275208.1）開放閱讀框為1 323 bp，編碼439個氨基酸，微生物來源的TP大小約47 kD。本實驗利用了touch down PCR技術，設置退火溫度由70℃梯度降落至60℃，將linker和flag序列分別加到deoA基因的上下游。

圖1-A顯示了約1 392 bp的降落PCR產(chǎn)物條帶，測序結果證實重組質粒上E. coli K12來源的deoA基因序列和NCBI數(shù)據(jù)庫已有序列一致，deoA基因上下游分別有l(wèi)inker和flag的核苷酸序列。

圖1-B為不同濃度G418-MD板上的酵母轉化子基因組以deoA-pKFS-F1、deoA-pKFS-R1為引物的PCR結果。為降低假陽性的影響，根據(jù)FS部分片段設計了FS-F、FS-R引物。以圖1-B中的陽性克隆對應的基因組為模板，用pPIC9K通用引物5' AOX1、3'AOX1引物和FS-F、FS-R引物分別進行PCR，鑒定結果如圖1-C、D。FS片段對應的基因序列為2 622 bp，F(xiàn)S-deoA基因序列約4 024 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序，未出現(xiàn)移碼突變。根據(jù)PCR結果，選出了拷貝數(shù)較高的5 mg/mL G418-MD板上的酵母轉化子，進行后續(xù)誘導表達融合蛋白的實驗。

2.2 免疫熒光檢測酵母

取誘導96 h的酵母轉化子和野生酵母做免疫熒光檢測（FITC，激發(fā)波長488 nm），圖2-A顯示酵母轉化子在AlexaFluor 488熒光下被標記為綠色，部分野生酵母細胞有微弱的自熒光。結果表明Flo1蛋白N端亞基可以作為表面展示的錨定蛋白，帶有flag標簽的TP被成功錨定在細胞壁上，呈不均勻的分布狀態(tài)。

2.3 Western blot檢測融合蛋白的誘導表達

將不同誘導時間點的酵母轉化子破壁，提取細胞壁蛋白做Western blot。Western blot結果（圖3）證實畢赤酵母在甲醇誘導的第3、4天是外源蛋白表達關鍵期，表達量相對較高。

圖1 deoA序列的PCR擴增和陽性酵母轉化子鑒定

圖2 酵母的免疫熒光檢測結果

E. coli來源的TP為47 kD，F(xiàn)S-TP融合蛋白共有1 338 aa，理論分子量大小約為141 kD，而圖3所檢測到的蛋白條帶約70 kD，與理論預測不太相符。這種情況在其它文獻中也有報道［12，13］，酵母細胞在翻譯表達外源蛋白時，若出現(xiàn)連續(xù)兩個或兩個以上的堿性氨基酸相鄰的結構，這一結構很容易被一些酵母本身表達的蛋白酶如Kex2切斷，導致外源蛋白不完整。經(jīng)過序列分析，融合蛋白存在一處“RKKR”結構，若經(jīng)Kex2蛋白酶切割會得到大小為65 kD左右的融合蛋白，經(jīng)過酵母的翻譯后修飾如糖基化等過程，可能導致表觀分子量呈現(xiàn)為70 kD左右；另一方面，畢赤酵母表達分泌蛋白的機制比較復雜，酵母自身分泌的胞外酶以及細胞裂解后釋放的胞內(nèi)酶，或破壁過程中的一些處理如超聲等也許會導致外源蛋白降解。融合蛋白表觀分子量變低的原因還需要進一步研究。

2.4 TP的催化活性檢測

圖4為反應體系稀釋20倍后的HPLC檢測結果，出現(xiàn)了產(chǎn)物胸腺嘧啶的色譜峰，以GS115原始菌株做對照的反應體系則未檢測到產(chǎn)物峰的出現(xiàn)。計算得β-胸苷的轉化率為7.5%。胸腺嘧啶和胸苷標準品的保留時間分別是7.079 min和9.692 min。分別在波長為264.1 nm和266.5 nm處有最大吸收峰，圖4中的兩個峰對應的波長分別與胸腺嘧啶和胸苷的標準品相一致，保留時間分別是7.761 min和10.444 min。

圖3 融合蛋白的表達分析

圖4 HPLC檢測圖

3 討論

本研究利用表面展示TP的酵母細胞作為全細胞催化劑，分別在30℃、40℃、50℃、60℃的反應溫度下，以50 mmol/L pH7.5的磷酸鹽緩沖液配制反應體系，以胸苷為底物進行催化反應，結果表明50℃是最優(yōu)反應溫度，在此溫度下胸苷的轉化率最高為7.5%。為探索不同pH值對反應的影響，制備了pH值為6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸鹽緩沖液，在50℃條件下進行了催化反應，結果表明pH7.5是最優(yōu)反應pH值。但相比于表達TP的重組E. coli工程菌［14］，畢赤酵母轉化子的催化效率仍相對較低，文獻利用E. coli BL21菌株共表達了TP和尿苷磷酸化酶（UP），在50℃時，將E. coli重組菌株與30 mmol/L尿嘧啶和60 mmol/L β-胸苷混合反應1 h，TP和UP共同催化生成了2-脫氧尿苷，反應的轉化率可以達到61.6%。

Flo1蛋白的N端亞基可以非共價錨定TP的N端，使TP蛋白C端游離。微生物來源的TP為同源二聚體，每個亞基有一個磷酸根結合位點和一個脫氧核苷結合位點。當TP被錨定在細胞壁表面時，錨定蛋白可能影響到TP的空間構象和TP亞基之間的相互作用，繼而阻礙TP對核苷類底物的催化，導致底物轉化率較低。本實驗室正在嘗試利用另外的錨定蛋白和酵母展示系統(tǒng)來展示TP。

酵母表面展示TP還有待更深入的研究，需要選用更適合的錨定蛋白和展示系統(tǒng)，以進一步提高TP的活性和表達量。此外，利用畢赤酵母密碼子偏好性［15］，對deoA基因序列進行優(yōu)化，并將畢赤酵母表面展示技術作為篩選手段進行定向進化［16］，或許可以提高TP在酵母細胞內(nèi)的表達量，進而篩選出催化能力更高的TP和穩(wěn)定性高的展示系統(tǒng)，為開發(fā)高穩(wěn)定性、高活性的表面展示TP全細胞催化劑奠定了基礎。

本研究還嘗試以5-氮雜胞苷為底物，但未能成功催化生成5-氮雜胞嘧啶，說明TP有一定的底物選擇特異性，無法單獨催化胞嘧啶核苷類衍生物的生成。有文獻報道TP可以催化嘧啶類脫氧核苷酸或5-位取代的尿嘧啶類化合物，但脫氧胞苷類和6-C被甲基或酮基取代的核苷類化合物除外，另外TP也不能以尿嘧啶和胸腺嘧啶的氮雜類衍生物為底物［17，18］。

在催化合成核苷類衍生物的過程中，可嘗試利用酵母表面展示系統(tǒng)同時展示兩種核苷磷酸化酶，進行雙酶反應［19］，提高全細胞催化劑對核苷類化合物的底物適應性，來催化合成更多的非天然核苷類似物。

4 結論

本研究利用酵母表達質粒pKFS，首次構建了胸苷磷酸化酶的畢赤酵母表面展示系統(tǒng)。通過兩步法的發(fā)酵方法，誘導酵母表達外源蛋白TP，確定了甲醇誘導的第3、4天是酵母表達外源蛋白TP的高峰期。并將展示TP的酵母細胞作為全細胞催化劑，以胸苷為底物催化合成了胸腺嘧啶。

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（責任編輯李楠）

Construction of Pichia pastoris Surface Display Technology as Wholecell Biocatalyst for Thymidine Phosphorylase

WANG Jie YU Lei YANG Dong LI Jie WANG Hong-zhong
（School of Life Sciences，Tsinghua University，Beijing 100084）

Thymidine phosphorylase（TP）extensively involves in nucleoside metabolism and catalyzes the formation of many nucleoside analogs（NA）. A yeast cell surface display system for TP was firstly constructed in this study as whole-cell biocatalyst. A deoA gene encoding TP was cloned from Escherichia coli K12 strain and inserted into the yeast expression vector pKFS. Recombinant vector was linearized and electro-transformed into Pichia pastoris GS115 cells. High copy transformant was induced by methanol for 96 h， and the results of immunofluorescence indicated that TP successfully displayed on the surface of P. pastoris. β-thymidine was used as substrate and recombinant GS115 cells as whole-cell biocatalyst， HPLC analysis demonstrated that TP on the surface of P. pastoris had catalytic activity， and catalyzed the production from β-thymidine to thymine.

thymidine phosphorylase；whole-cell catalysis；Pichia pastoris；surface display

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.032

2015-03-31

國家自然科學基金項目（21176138，21476124）

王潔，女，碩士，研究方向：生物轉化及生物催化；E-mail：wangjie08beijing@163.com

王洪鐘，男，博士，副教授，研究方向：生物轉化及生物催化；E-mail：hzwang@mail.tsinghua.edu.cn