日本結縷草‘膠東青’DREB2.2基因克隆及表達模式研究

可祥 農鈞琇 石大林 馬禮鵬 李京 韋善君

（中央民族大學生命與環境學院，北京 100081）

日本結縷草‘膠東青’DREB2.2基因克隆及表達模式研究

可祥 農鈞琇 石大林 馬禮鵬 李京 韋善君

（中央民族大學生命與環境學院，北京 100081）

DREB（dehydration responsive element binding protein）是植物中普遍存在的一類重要轉錄因子，參與植物逆境響應和生長發育過程。以日本結縷草‘膠東青’為材料，克隆獲得了DREB2.2基因的編碼區序列，分析了該基因的生物信息學特征，通過半定量PCR技術檢測其逆境表達模式。測序結果表明，‘膠東青’DREB2.2 基因存在長、短兩個轉錄本。長轉錄本DREB2.2-L編碼區長1 067 bp，多含一個長50 bp的序列，閱讀框提前終止，僅推測編碼65個氨基酸。短轉錄本DREB2.2-S編碼區長1 017 bp，推測編碼338個氨基酸，蛋白質分子量37.3 KD，等電點 pI為4.86，含有一個保守的AP2結構域和核定位序列，屬于DREB亞家族A-2組成員。半定量PCR結果顯示，DREB2.2-S和DREB2.2-L在正常生長條件下有表達，低溫脅迫時表達量上調，脅迫2 h時最高，干旱脅迫2 h和24 h時輕度上調表達，高鹽脅迫下表達量無顯著變化。在相同條件下，DREB2.2-L的表達量均略高于DREB2.2-S。

日本結縷草‘膠東青’；轉錄因子；DREB；非生物逆境

結縷草（Zoysia Willd）隸屬于禾本科（Gramineae）畫眉草亞科（Eragrostoideae），是一種多年生C4型低矮草本植物，主要分布于亞洲和大洋洲。該屬植物的5個種，即日本結縷草（Zoysia japonica Steud.）、中華結縷草（Zoysia sinica Hance）、大穗結縷草（Zoysia macrostachya Franch. et Sav）、溝葉結縷草（Zoysia matrella）和細葉結縷草（Zoysia tenuifolia Willd. ex Trin）［1］，具有耐高溫和干旱、耐修剪、匍匐生長、耐踐踏的優點，是開發作為草坪草的理想草種。目前在全球種植的結縷草品種有17個左右，廣泛用于運動場草場、公用綠地、家庭草坪、高爾夫球場果嶺和固沙保土草坪的建植。由于多變的自然環境，草坪的完整性和觀賞性常常受到低溫、干旱和鹽堿等非生物因素的威脅。抗逆機制和抗逆育種研究仍然是結縷草育種工作的重要內容之一。

近年來人們對模式植物擬南芥、水稻等植物材料的抗逆分子機制研究結果為結縷草的相關研究提供了參考。對擬南芥的研究發現，轉錄因子DREB（Dehydration responsive element binding protein）在逆境應答中起重要作用。DREB屬于AP2超家族，包括6個亞組，即DREB1-DREB6，其中DREB1和DREB2與植物逆境響應關系最密切，能特異結合啟動子中含有的DRE/CRT順式元件，激活許多逆境誘導基因的表達，增強植物對逆境的忍耐能力。其中，DREB1B/CBF1、DREB1C/CBF2和DREB1A/CBF3主要與低溫應答相關［2-5］，DREB1D/CBF4主要參與干旱脅迫相應［6］，而DREB1E/DDF2和DREB1F/DDF1主要參與鹽脅迫響應［7］。DREB2組有8個基因，主要對干旱、高鹽和高溫脅迫響應［8-11］。在其他多種植物中，包括水稻［12］、玉米［13］、大麥［14，15］、小麥［16］、油菜［17］等農作物，黑麥草［18，19］、狗牙根［20］等草坪草，均克隆獲得了多個DREB1和DREB2基因，它們在基因序列和功能上都有不同程度的相似性。對同一物種不同種質的比較研究結果表明，不同種質之間抗逆能力差異與DREB1/CBFs和DREB2的基因結構或表達差異相關。例如，玉米的ZmDREB2.7的表達與幼苗的抗旱性相關［13］；不同生態型擬南芥中，CBF2基因結構和表達、CBFs基因調節子的表達差異與種質抗寒能力差異相關［21-23］；大麥的一個CBF基因簇與耐凍和越冬性的遺傳位點FR-2的遺傳定位一致［15］；一粒小麥（Triticum monococcum）中含有11個CBF基因的基因簇被定位到 5號染色體的Fr-Am2抗凍位點上［16］；冬小麥中CBF14的拷貝數比春小麥的高［24］。結縷草作為一種多耐逆性的草種，其DREB基因與抗逆性的關系值得研究。

本研究以我國山東膠州灣的結縷草‘膠東青’變種為材料，克隆獲得到一個新DREB A-2亞組基因，分析該基因在低溫、干旱和高鹽脅迫下的表達調節，以期為結縷草DREB基因研究積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用植物材料為日本結縷草‘膠東青’變種（Zoysia japonica var. pallida cv Jiaodong），由青島海源草坪有限公司贈送。RNA 提取用 RNAPrep pure 植物總RNA提取試劑盒（北京天根生物工程公司），mRNA反轉錄用M-MLV（Progema），質粒提取試劑盒、瓊脂糖DNA快速膠回收試劑盒和T-載體（pUMT）連接試劑盒均購自北京百泰克生物工程有限公司，PCR擴增用的普通PCR mix 和高保真的Pfu mix購自TaKaRa公司。試驗用引物均由上海生物工程有限公司合成，引物名稱及序列見表1。

表1 實驗用引物

1.2 方法

1.2.1 植物材料培養及逆境脅迫處理 從‘膠東青’草坪中采集匍匐莖段回溫室內培養，基質為營養土、珍珠巖和蛭石以2∶1∶1比例的混合物，培養溫度25℃-28℃，光周期14 h/d。室內培養6月后，選取生長狀態良好、長勢基本一致的材料進行逆境處理，方法如下：

（1）低溫脅迫：材料轉到植物生長箱中培養，4℃恒溫，光周期14 h/d；（2）PEG模擬干旱脅迫：用PEG6000濃度為20%的營養液澆灌根部至流出溶液為培養基質體積的兩倍以上，然后將培養缽放到托盤中，在托盤加淺層澆灌液，溫室內繼續培養；（3）高鹽脅迫：用NaCl濃度為200 mmol/L的營養液澆灌根部，方法同PEG處理。

3種逆境脅迫時間分為2、24和72 h。以室溫培養的材料為低溫處理的對照，以澆灌營養液的材料為高鹽脅迫和PEG模擬干旱脅迫處理的對照。取對照和逆境處理材料上部第1-2展開葉，液氮速凍后貯存于-80℃冰箱中。

1.2.2 RNA的提取與cDNA的制備 將葉片在液氮中研磨，用植物總RNA 提取試劑盒提取RNA，電泳檢測RNA的完整性，用NanoDrop2000超微量分光光度計（美國Thermo公司）檢測RNA濃度。再以Oligo dT為引物，用M-MLV將mRNA反轉錄為cDNA，具體操作按照說明書進行。以Actin1為內標基因，用其cDNA特異性引物Pactin-F和Pactin-R對cDNA 進行PCR擴增，檢測反轉錄效果。1.2.3 DREB2.2基因的克隆 以低溫脅迫2 h的cDNA 為模板，用引物P1、P2和 Pfu mix進行PCR擴增，產物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳。回收DNA片段，連接到載體pUM-T上，并測序。對測序獲得的基因序列，用Conserved Domain Search Service（CD Search）工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi）預測其保守結構域。蛋白質的等電點、分子量和二級結構用ExPASy網站相關軟件完成；亞細胞定位信息用PSORT Prediction（http：//psort.hgc. jp/）預測；蛋白模型用Built Model（http：//swissmodel. expasy.org/interactive）以及RaptorX（http：//raptorx. uchicago.edu/）工具預測。用DNA man 6.0制作基因的系統進化樹。

1.2.4 逆境脅迫下基因表達模式 以cDNA 為模板，先用Pactin-F和Pactin-R對內標基因進行23個循環的PCR擴增，產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，確定條帶亮度基本一致時各處理的cDNA用量。然后以該用量的cDNA為模板，分別用引物PLF+PLS-R和PS-F+PLS-R組合，對各處理cDNA 進行31個循環的PCR擴增，產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，比較各處理條帶亮度。

2 結果

2.1 RNA提取和反轉錄效果

提取的RNA電泳結果顯示，各樣品中28S和18S條帶清晰完整，兩條帶亮度比例為2∶1左右。用Nano Drop 2000超微量分光光度計檢測結果表明，各樣品RNA的A260/280比值均大于2，說明RNA無明顯的蛋白質污染。對RNA進行反轉錄制備獲得的cDNA樣品，用Actin1的cDNA特異性引物進行PCR擴增，結果都產生了約450 bp左右的特異帶，說明所有樣品RNA反轉錄效果良好。

2.2 DREB2.2基因的克隆

以低溫處理2 h 樣品的cDNA 為模板，用DREB2.2基因特異性引物進行PCR擴增，獲得了1 000 bp左右的特異帶（圖1）。回收該條帶并克隆到pUM-T載體中。對10個可能重組子進行PCR鑒定，結果（圖2）顯示，有7個在1 000 bp附近均產生高亮度的特異帶，其中1號、6號和9號的條帶位置略低，4號、5號、8號和10號的條帶略高，推測PCR產物中可能存在兩種長短不同的轉錄本。選擇6號和9號、8號和10號重組子進行測序，結果（圖3）證實了我們的推測，前兩者克隆的核酸序列長1 017 bp，后兩者克隆的核酸序列從第75位堿基開始有50 bp的插入序列，總長1 067 bp。

2.2 DREB2.2基因的序列分析

本研究將DREB2.2的長、短轉錄本分別命名為DREB2.2-L和DREB2.2-S。由于含有50 bp的插入序列，DREB2.2-L的閱讀框提前終止，僅推測編碼65個氨基酸。DREB2.2-S有完整的閱讀框，推測編碼蛋白含338個氨基酸（圖3）。這兩個序列均已登錄到NCBI網站上，登錄號分別為KP676131 和KP676132。

圖1 DREB2.2基因的RT-PCR擴增

圖2 DREB2.2核酸片段與克隆載體重組子的PCR鑒定

圖 3 DREB2.2基因兩個轉錄本的序列比較

DREB2.2-S推測編碼的蛋白質分子量37.3 kD，等電點 pI為4.86。氨基酸序列的疏水性/親水性分析結果表明，第24-33位氨基酸區域的親水性最強，疏水區域中，第156-164位氨基酸疏水性最強。氨基酸序列中18%為α-螺旋，5%為β-折疊，76%為無規則卷曲。第89-145位氨基酸構成一個AP2結構域（圖4-A），其三維模型與擬南芥ERF1A（At4g17500）中的AP2/ERF結構域PDB2gcc：A的模型高度相似（P-value：2.94e-04）。亞細胞定位分析結果顯示，第23-32位氨基酸（PGRKKRPRRS）為細胞核定位序列（NLSs）。DREB2.2-S整體蛋白的結構模型預測，見圖4-B。

在NCBI網站上進行蛋白BLAST分析結果（圖5）表明，與DREB2.2-S相似度最高的前5個基因分別來自高粱（Sorghum bicolor），谷子（Setaria italic）、玉米（Zea mays）、羊草（Leymus chinensis）和四倍體小麥硬粒亞種（Triticum turgidum subsp. Durum），它們與DREB2.2-S在核定位序列和AP2結構域序列上高度相似，但在基因的C端差異較大。基因系統進化分析結果（圖6）顯示，DREB2.2-S被歸到A2亞組，與高粱、玉米、谷子中的同源基因遺傳距離較近。

2.3 DREB2.2在逆境脅迫下的表達變化

以Actin基因為內標，采用半定量PCR技術研究DREB2.2基因在低溫、干旱和高鹽脅迫下的表達變化。在相同cDNA用量條件下，Actin1基因進行了23個循環的擴增，DREB2.2-L和DREB2.2-S進行了31個循環的擴增。產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖7）顯示，在正常生長條件下，DREB2.2-S和DREB2.2-L的擴增均獲得了比較亮的特異帶，說明兩者均為組成型較高水平表達。干旱脅迫2 h和24 h時，兩種序列均略受上調表達；低溫脅迫時，兩序列均受上調表達，脅迫2 h時表達量最高；在高鹽脅迫下，兩序列表達均無明顯響應。總體上，相同條件下DREB2.2-L的條帶亮度均比DREB2.2-S的稍亮一些，說明前者的表達量略高

3 討論

結縷草作為一種多耐逆植物，其DREB基因結構、功能和表達模式值得研究。Wang等［25］克隆獲得了首個結縷草DREB A-2亞組的基因（ZjDREB-2.1），過量表達該基因的擬南芥植株的抗寒性明顯高于野生型。馮勛偉和才宏偉［26］以日本北海道地區的耐寒生態型室蘭（Murorann）和日本九州地區的不耐寒生態型俵山北（Tawarayamakita）為材料，克隆獲得了結縷草的首個DREB A-1亞組基因ZjCBF，在擬南芥中超表達該基因可增強植株抗凍能力。本研究以結縷草‘膠東青’變種為材料，克隆獲得該屬植物的第2個DREB A-2亞組的基因，命名為DREB2.2。

圖 4 DREB2.2-S蛋白AP2/EREBP結構域（A）和3D模型（B）

結縷草DREB2.2基因有兩個轉錄本，長轉錄本DREB2.2-L在第75位堿基處插入50 bp的序列，導致閱讀框提前終止，僅編碼65個氨基酸，短轉錄本DREB2.2-S 包含完整的閱讀框，推測編碼蛋白含338個氨基酸，與ZjDREB2.1氨基酸序列相似度為33.14%。在DREB亞家族基因的進化系統中，DREB2.2-S 屬于A-2組，與高粱、玉米、谷子的同源基因遺傳距離較近，而與ZjDREB2.1處于A-2亞組中的不同分枝上，推測結縷草的這兩個基因有不同的禾本科DREB2基因祖先。DREB2基因的多種轉錄剪接方式在其他禾本科植物中也有報道。玉米的ZmDREB2A有兩個轉錄本，長轉錄本ZmDREB2A-L多含一個53 bp的序列，編碼區提前終止，僅推測編碼89個氨基酸，而短轉錄本ZmDREB2A-S編碼蛋白屬于DREB2亞組［27］。大麥的HvDRF1和小麥的TaDRF1基因有3個轉錄本，其中兩個轉錄本可以翻譯產生DREB2類轉錄因子［28］。Qin等［27］根據他們對玉米ZmDREB2A基因的研究結果認為，單子葉和雙子葉植物在一些DREB2基因活性調控方式上有差異，前者通過轉錄剪接調節，后者通過磷酸化調節，本研究結果支持了這個觀點。由于有生理活性的DREB2基因的超表達影響植株的生長發育［9，27］，采用可變剪接產生無活性轉錄本的調節方式，可能有利于減輕基因的負面效應，使植株正常生長。

圖 5 DREB2.2-S與5個相似度最高的直系同源基因氨基酸序列的比較

多數DREB2基因具有逆境應答特性，不同物種中DREB2基因的逆境響應模式有差異。擬南芥中的DREB2A、DREB2B基因的表達受干旱和高鹽誘導，而對低溫誘導無明顯響應［29］。菊花（Dendranthema vestitum）DvDREB2A基因表達受低溫誘導的強度是干旱和高鹽誘導強度的8-15倍左右［30］。珍珠狼尾草（Pennisetum glaucum）PgDREB2A基因表達對干旱脅迫響應較早，但在低溫脅迫下上調幅度比在干旱脅迫和高鹽脅迫下的高［31］。胡楊（Populus euphratica）的PeDREB2基因對高鹽脅迫響應較低溫和干旱脅迫的滯后［32］。玉米ZmDREB2A基因的兩個長、短轉錄本在常溫下表達量非常低，在低溫和鹽脅迫下兩者均上調表達，其中有生理功能的ZmDREB2A-S上調幅度更大［27］。本研究表明，結縷草的DREB2.2的兩個轉錄本在正常生長條件下有表達，在干旱脅迫下，兩種剪接本在24 h內均略上調表達；在低溫脅下，兩序列均在2 h時表達量最高；高鹽脅迫下，兩序列表達均無明顯響應。在相同條件下，DREB2.2-L的表達量均略高于DREB2.2-S的量或與其相當。轉基因研究表明，DREB2基因超表達后可增強植株抵抗低溫、干旱和高鹽等非生物逆境的能力。擬南芥組成型活性DREB2A基因的超表達明顯增強擬南芥植株的抗旱能力，但未增強抗凍能力［9］。超表達PgDREB2A基因的煙草植物抗高鹽和干旱脅迫能力增強［33］。Chen 等［34］用大豆轉錄因子 GmDREB2 轉化擬南芥，干旱處理（19 d 不澆水）后野生型全部死亡，而轉基因植株的成活率可高達45.9%，證明轉基因植株抗旱能力有明顯提高。組成型表達玉米ZmDREB2A-S的擬南芥植株抗旱能力增強，植株矮壯，發育遲緩。結縷草DREB2.2-S編碼的蛋白質屬于DREB2亞組轉錄因子，在氨基酸序列上與高粱、谷子、玉米的同源基因高度相似，推測它具有DREB2亞組基因類似的生理功能，參與結縷草抗逆生理過程。

圖6 DREB2.2-S基因的系統發育樹

4 結論

結縷草‘膠東青’DREB2.2基因含DREB2.2-L和DREB2.2-S兩個轉錄本，前者閱讀框不完整，推測后者編碼的蛋白質屬于DREB轉錄因子亞家族A-2亞組，與高粱、谷子、玉米的同源基因親緣關系較近。DREB2.2-L和DREB2.2-S為組成型表達，表達量受低溫和干旱誘導上調，可能參與結縷草抗逆生理過程。

圖7 逆境脅迫下DREB2.2的表達

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（責任編輯馬鑫）

Cloning and Expression Profile of DREB2.2 Gene from Zoysia japonica var. pallida cv Jiaodong

KE Xiang NONG Jun-xiu SHI Da-lin MA Li-peng LI Jing WEI Shan-jun
（College of Life and Environmental Sciences，Minzhu University of China，Beijing 100081）

DREB（dehydration responsive element binding protein）is a type of transcription factor commonly existing in higher plants，and involves in abiotic stress response and the process of growth and development. In this study， using Zoysia japonica var. pallida cv Jiaodong as material， the coding sequence of gene DREB2.2 was cloned， then the bioinformatics were analyzed， and the expression profile of the gene in the stress environment was detected by semi-quantitative PCR technique. Sequencing analysis indicated that DREB2.2 had 2 transcripts of long and short. The long transcript， DREB2.2-L， was 1 067 bp in length， with a premature ORF because of a 50 bp insertion sequence， and putatively encoding 65 amino acids. The short one， DREB2.2-S， was 1 017 bp in length， encoding 338 amino acids；the putative protein was 37.3 kD， pI was 4.86， and it belonged to the A-2 group of DREB subfamily， containing an AP2 conservative structure domain and nuclear localization sequence. The results of semi-quantitative PCR showed that both DREB2.2-S and DREB2.2-L were expressed in normal condition，the expressions were up-regulated under low temperature stress with the highest level at 2 h exposure， and were slightly up-regulated during the 2 h and 24 h of drought stress， but showed no response to high salt stress. In both normal and stress conditions， the mRNA amount of DREB2.2-L was slightly higher than that of DREB2.2-S.

Zoysia japonica var. pallida cv Jiaodong；transcription factor；DREB；abiotic stress.

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.020

2015-03-30

國家自然科學基金項目（31100507），中央民族大學大學生創新訓練項目（BEIJ2014110012，URTP2014110029，GCCX-2015110020）

可祥，男，碩士研究生，研究方向：生物化學與分子生物學，E-mail：706320299@qq.com；農鈞琇與石大林為本文并列第一作者

韋善君，女，博士，講師，研究方向：植物生理與分子生物學，E-mail：wei.s.j@163.com