馬鈴薯突變體赤霉素代謝關鍵酶基因差異表達分析

石建斌楊永智，2王艦，2

（1.青海大學，西寧 810016；2.青海省農林科學院 教育部青藏高原生物技術重點實驗室 青海省高原作物種質資源與利用重點實驗室，西寧 810016）

馬鈴薯突變體赤霉素代謝關鍵酶基因差異表達分析

石建斌1楊永智1，2王艦1，2

（1.青海大學，西寧 810016；2.青海省農林科學院 教育部青藏高原生物技術重點實驗室 青海省高原作物種質資源與利用重點實驗室，西寧 810016）

為揭示馬鈴薯株高突變與赤霉素代謝途徑關鍵酶基因的關系，以馬鈴薯株高突變株系4P2-9為材料，利用實時熒光定量PCR方法中的相對定量RT-PCR建立雙標準曲線，以Actin基因為內參基因，對高原4號及其株高突變材料4P2-9中的赤霉素代謝相關基因的表達情況進行了檢測。結果顯示，4P2-9的株高及節間數顯著低于對照材料（P＜0.05），節間長度顯著高于對照（P＜0.05），赤霉素代謝的關鍵酶基因KS、KO和GID1表達量顯著下調，分別為對照材料的0.725倍、0.657倍和0.890倍；GA20ox1和GA2ox1基因的表達量表現為上調，分別為對照材料的1.557倍和1.425倍。結果表明，赤霉素代謝過程中關鍵酶基因表達量的改變是造成4P2-9材料株高變化的原因之一，而GA20ox1和GA2ox1基因的表達量的上調是促使株高降低的主要因素。

馬鈴薯；株高突變；赤霉素；基因表達量

赤霉素（Gibberellin，簡稱GA）是一個較大的萜類化合物家族，在植物的整個生長發育周期中起調節作用。作為一種重要的植物激素，赤霉素參與控制多種多樣的植物發育過程，包括種子萌發、莖的伸長、根的生長、葉片伸展、表皮毛發育、花粉管生長、花和果實的發育等［1，2］。赤霉素生物合成途徑可分為3個階段，參與其合成的關鍵酶主要包括古巴焦磷酸合成酶（Copalyl pyrophosphate synthase，CPS）、內-貝殼杉烯合成酶（Ent-kaurene synthase，KS）、內-貝殼杉烯氧化酶（Ent-kaurene oxidase，KO）、GA-20氧化酶（GA-20 oxidase）、GA-3氧化酶（GA-3 oxidase）以及GA-2氧化酶（GA-2 oxidase）等［3］。

CPS是調節GA生物合成途徑一個重要的酶，決定了GGPP向GA方向合成，同KS一樣位于前質體，且具有引導序列。CPS能夠催化生物合成途徑中從牻牛兒焦磷酸（Geranylpyrophosphate，GGPP）形成古巴焦磷酸（Copalyl pyrophosphate，CPP），為催化環化雙萜形成的第一步。KS則催化CPP形成內-貝殼杉烯，即為赤霉素的前身。KO是一種位于內質網，與膜結合的依賴細胞色素P450和NADPH的單加氧化酶，經三步反應將內-貝殼杉烯氧化為內-貝殼杉烯酸。GA-20氧化酶和GA-2氧化酶是重要的GA生物合成和調控酶，為可溶性的雙加氧酶，由小的多基因家族編碼，目前大約有20-30種的GA-20氧化酶基因被克隆［4］。GA-20氧化酶是嚴格調控的酶，既受反饋調節，又受光周期調控。GA-20氧化酶底物專一性不強，其對底物的親和力與C-13位的羥基化有關，形成GA代謝的2個或多個平行形成途徑，這與植物中具有生物活性的GAs類型相一致［5］。GA-2氧化酶主要作用于有生物活性的GA1和GA4，使兩者在C-2位羥基化轉變成無活性的GA8和GA34，并且維持著植物體內具有生物活性的GAs和C19-GAs中間體之間的平衡。赤霉素受體GID1（Gibberellin insensitive dwarf1）是一種可溶性蛋白，與赤霉素結合形成二聚體，將赤霉素的信號傳遞給下游元件，在植物體上產生赤霉素效應［6］。自20世紀60年代起，由于水稻sd1基因和小麥Rht1基因在育種中的應用，極大地提高了世界主要糧食作物的產量，即“綠色革命”［7，8］。最近的研究表明主要農作物的“綠色革命”都與赤霉素密切相關［9，10］。目前，在分子水平上研究赤霉素的表達調控已成為植物激素研究領域中的前沿和熱點［11-13］。

實時熒光定量PCR為目前常用檢測基因表達量的方法，具有比Northern blot成本低，操作簡便，省時省力，高精確度和高靈敏度等特點，能夠檢測表達豐度較低的mRNA，已經成為基因表達分析的首選方法［14，15］。

本研究以馬鈴薯株高突變株系為材料，通過細胞學觀察及實時熒光定量PCR方法，分析突變系體細胞特征并檢測赤霉素代謝途徑中關鍵酶基因的表達情況，旨在為進一步了解馬鈴薯中赤霉素作用的分子機理提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 馬鈴薯材料 高原4號來源于青海省農林科學院生物技術中心，4P2-9為本實驗室利用RNA干涉沉默馬鈴薯卷葉病毒篩選出的株高變異突變系。1.1.2 儀器和試劑 iQ5 實時熒光PCR儀（Bio-Rad），高速冷凍離心機，PCR儀，水平凝膠電泳儀，凝膠成像系統，電子顯微鏡，微量移液槍（Eppendorf）。

2×SYBR Green I Mix 購自上海生物工程公司，0.2 mL平蓋八聯管購自Bio-Rad公司，RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒、Fast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、RNase-Free DNase I、10×buffer、dNTP、Taq聚合酶均購自天根生物公司。

1.2 方法

1.2.1 材料的準備 從基因庫中分別取高原4號和突變株系4P2-9的組培苗，切取帶芽莖段于基本培養基MS中，在本實驗室的培養間培養30 d（培養溫度為白天25℃、夜間21℃，光照為14 h/d，采用日光燈補光）。

1.2.2 馬鈴薯形態指標測量與細胞學觀察 分別挑取高原4號和4P2-9組培苗各10株測量每株組培苗植株高度，并統計節間數。用鑷子小心撕取組培苗中部莖段表皮，用稀碘染色后制作細胞觀察玻片，并用電子顯微鏡觀察細胞結構。

1.2.3 馬鈴薯總RNA提取與質量檢測 稱取馬鈴薯材料葉片0.1 g在液氮中迅速研磨成粉末，用植物總RNA提取試劑盒提取馬鈴薯材料的總RNA，具體步驟按試劑盒說明書操作進行。提取的RNA用核酸測定儀測定濃度和純度，并用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，-80℃保存備用。

1.2.4 RT-PCR合成cDNA鏈 逆轉錄反應體系為20 μL，在0.2 mL RNase free的離心管中加入5×gDNABuffer 2 μL、Total RNA 5 μL、RNase-Free ddH2O 3 μL，混勻并簡短離心，置于42℃孵育3 min，然后置于冰上放置2 min。在上述體系中加入10×Fast RT Buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 1 μL、FQ-RT Primer Mix 2 μL、RNase-Free ddH2O 5 μL，充分混勻，42℃孵育15 min，95℃孵育3 min，-20℃保存備用。

1.2.5 引物的設計 赤霉素代謝途徑中的關鍵酶主要有CPS1、KS、KO、GA2ox1、GA20ox1及赤霉素受體基因GID1，參考水稻、葡萄、番茄等植物赤霉素代謝關鍵酶基因序列［16-18］，用DNA STAR軟件分析其同源性，在保守序列內用Primer Premier 5設計特異性引物，以馬鈴薯內源持家基因Actin作為內參基因［19］，所有引物（表1）由上海生物工程公司合成。

表1 引物序列表

1.2.6 相對定量RT-PCR分析 以高原4號和4P2-9材料的cDNA為模板，用各基因的特異性引物進行PCR擴增，并以PCR產物為模板進行10倍（100、10-1、10-2、10-3和10-4）梯度稀釋，用于建立各目的基因和內參基因的標準曲線。反應中，各目的基因分別與內參Actin基因兩兩一組，構建標準曲線的同時擴增高原4號和4P2-9材料中相應目的基因和內參Actin基因。反應體系為20 μL，包含10 μL 2×SYBR Green I，引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應程序為：95℃ 3 min；95℃ 10 s，退火 20 s，72℃ 30 s，40個循環，內參基因、外源基因的熔解曲線的測定均是從65℃到95℃，每0.2℃/5 s測定吸光值1次。每個樣品設3個重復，結果取平均值，參照Pfaffl法［20］，通過目的基因與內參基因的擴增效率（E）和CT值來計算目的基因的相對表達量（C），C=EΔCT/E（目的基因）ΔCT（內參基因），ΔCT=CT目的基因-CT內參基因，E擴增效率=10-1/r，r為標準曲線斜率。以此計算目的基因的相對表達量，并與株高性狀進行相關性分析。

2 結果

2.1 馬鈴薯株高統計及細胞學觀察

分別統計馬鈴薯材料4P2-9及對照材料高原4號的株高和節間數，隨機挑選10株測量，做3次重復，所得數據經DPS統計軟件統計分析，結果（表2）顯示，對照組高原4號材料的平均株高為16.00 cm，4P2-9材料的平均株高為12.45 cm，較對照偏低，且兩者之間的差異達到了顯著水平（P＜0.05）。4P2-9材料的平均節間數為7.9，較對照組的13.00顯著偏小，且該差異也達到了顯著水平（P＜0.05）。4P2-9材料的平均節長與對照組相比，達到顯著差異水平（P＜0.05）。

通過對4P2-9材料和高原4號材料的細胞學觀察（圖1）發現，兩者莖段細胞狹長，均呈不規則狀，細胞排列緊密且大小不一，兩者在細胞排列及個體伸長方面均無明顯差別。說明4P2-9材料的株高突變性狀主要表現為莖段節間數的減少，其次為節間的增長，但這種增長并非是由節間細胞拉伸造成的。

2.2 標準曲線的建立

檢測提取的RNA經電泳完整性（圖2），并進行反轉錄合成第一鏈，分別以合成的cDNA為模板，以特異性引物進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后分別進行10倍梯度稀釋（100、10-1、10-2、10-3和10-4），以梯度稀釋的Actin基因PCR產物作為內參基因標準品，以梯度稀釋的各目的基因的PCR產物為外源基因標準品，以CT值為Y軸，以模板起始濃度的對數為X軸，建立各目的基因及內參基因的標準曲線，由圖3可知，模板起始濃度與CT值存在線性關系，內參基因Actin的擴增效率為110.90%，R2=0.995，各目的基因的擴增效率為82.2%-125.6%，R2為0.995-0.999，所有標準曲線的相關系數接近于1，熔解曲線為單峰，擴增產物特異性好，擴增曲線中的熒光值能夠準確反應目的產物的擴增。

表2 馬鈴薯材料株高性狀統計

圖1 馬鈴薯材料組培苗株高及節間細胞觀察

圖2 RNA檢測電泳圖

2.3 馬鈴薯赤霉素代謝途徑相關酶基因的表達分析

根據Pfaffl法分別計算了熒光定量PCR中馬鈴薯材料高原4號和4P2-9的CPS1、KS、KO、GA2ox1、GA20ox1和GID1基因的擴增效率（E）和表達量，結果（表3）顯示，以內參基因Actin為標準，CPS1、KS、KO、GA2ox1、GA20ox1和GID1基因在4P2-9中的相對表達量分別為1.00、0.76、0.53、 1.02、0.87和0.61；在高原4號中的相對表達量分別為0.99、1.05、0.81、0.66、0.61和0.69。在材料4P2-9中，CPS1和GA20ox1基因的表達量與內參基因基本一致，KS、KO、GA2ox1和GID1基因的表達量較內參偏低；在材料高原4號中，除KS外，其它基因的表達量較內參基因均偏低。

馬鈴薯CPS1、KS、KO、GA2ox1、GA20ox1和GID1基因在材料4P2-9和高原4號中的差異表達結果（圖4）顯示，與對照相比，各關鍵酶基因的相對表達量均有不同程度的變化，其中，4P2-9材料中的CPS1基因表達量變化不大，為正常水平的1.012倍左右，KS、KO和GID1基因表達量有不同程度的下調，下調幅度為對照材料的0.725倍、0.657倍和0.890倍左右；GA20ox1和GA2ox1基因的表達量表現為上調，上調幅度為對照材料的1.557倍和1.425倍左右。

圖3 目的基因與內參基因雙標準曲線的建立

表3 馬鈴薯材料赤霉素代謝關鍵酶基因表達情況

圖4 赤霉素代謝關鍵酶基因在4P2-9和高原4號中的相對表達結果

3 討論

赤霉素涉及植物生長發育的諸多方面，這必然要求植物對體內的赤霉素水平進行精確的調控。這種調控主要通過控制GA合成和代謝相關的酶基因的表達來實現。研究表明，赤霉素在株高生長發育過程中起著重要的調控作用［9］。Curtis等［21，22］的研究表明，當過量表達西葫蘆GA20-氧化酶會產生GA缺失突變體表型，如植株矮化、葉色加深等，轉基因植株內源GA含量降低。Lee等［23］克隆了菠菜的GA2-氧化酶基因，編碼含337個氨基酸殘基組成的蛋白，能夠在大腸桿菌異源表達，催化GA9和GA20轉變為GA51和GA29的反應，GA2-氧化酶維持著植物體內具有生物活性的GAs和C19-GAs中間體之間的平衡，過量表達GA2-氧化酶常會導致植株矮化，GA含量降低。

通過田間及組培苗株高統計發現，株高突變系4P2-9材料的株高顯著低于對照材料，主要表現為節間數的減少，但節間長度卻有所增長。經細胞學觀察，并未發現節間細胞的拉伸，說明造成4P2-9材料節間生長的原因并非為節間細胞的簡單拉伸。相對定量檢測結果表明，馬鈴薯赤霉素代謝的關鍵酶基因CPS1、KS、KO、GA2ox1、GA20ox1和GID1在4P2-9材料和高原4號中發生變化，其中KS基因和KO基因的表達量顯著下調，導致了在赤霉素代謝后期代謝階段GA20ox1基因和GA2ox1基因表達量的顯著上調，GA20ox1基因和GA2ox1基因的過量表達最終導致GA含量的降低，表現為赤霉素受體基因GID1的下降［24］，最終促使4P2-9材料的株高變化，GA20-氧化酶是嚴格調控的酶，既受活性GA反饋調節，又受光周期調控，過量表達GA20-氧化酶，植物通常會表現為節間伸長，葉色變淡等特征［25，26］，表明赤霉素代謝過程中關鍵酶基因表達量的改變是造成馬鈴薯材料株高突變的原因之一，其中GA20ox1和GA2ox1基因的表達量的上調是促使4P2-9材料株高降低的主要因素。另外，GA20ox1的過量表達還導致了突變材料節間長度的增長，而非簡單的細胞拉伸。

當外源T-DNA 整合進入植物基因組，會對宿主細胞的基因組造成改變，這種變化無論是對外源的T-DNA的表達還是植物基因的表達都會產生影響［27］。RNA干涉載體在馬鈴薯基因組中的隨機整合致使基因組發生了重排，這種重排包括植物基因組整合位點的刪除和重復，T-DNA 序列的刪除和重復，以及染色體上的易位和倒位［28］。特定位點基因序列的改變導致了基因表達量的變化，包括赤霉素代謝途徑中的關鍵酶基因，表現為本研究材料的株高突變。

4 結論

通過細胞學方法觀察馬鈴薯材料4P2-9的株高突變性狀主要表現為莖段節間數的減少，其次為節間的增長，且這種增長并非是由節間細胞拉伸造成的。利用Real-time PCR方法對赤霉素代謝途徑中關鍵酶基因的相對表達量分析表明，馬鈴薯材料4P2-9的KS和KO基因表達量顯著降低，GA20ox1和GA2ox1基因表達量顯著升高，為促使4P2-9材料株高降低的主要因素。

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（責任編輯馬鑫）

The Differential Expression of Genes for Key Enzymes in Gibberellin Metabolism in Potato Mutant

SHI Jian-bin1YANG Yong-zhi1，2WANG Jian1，2
（1. Qinghai University，Xining 810016；2. Qinghai Academy of Agricultural and Forestry Sciences，The Key Lab of Qinghai-Tibetan Plateau Biotechnology of Ministry of Education，Key Laboratory of Germplasm Innovation and Utilization of Plateau Crop in Qinghai Province，Xining 810016）

In order to reveal the correlation between the mutation of plant height and genes of key enzymes in gibberellin（GA）metabolic pathway， using the mutant strain 4P2-9 of potato as materials， we established double standard curve by relative quantitative RT-PCR，and tested the expression of GA metabolism-related genes in the “Plateau 4” and its mutant “4P2-9” using Actin gene as reference gene. The results showed that the plant height and the internode number of 4P2-9 significantly were lower than the control material（P＜0.05）；however，the internode length was significantly higher than the control（P＜0.05）， moreover the expressions of gene KS， KO and GID1 for key enzymes in GA metabolism were significantly down-regulated， and were 0.725， 0.657 and 0.890 times the control， respectively. The expressions of GA20ox1 and GA2ox1 genes were increased， and were 1.425 and 1.557 times the control， respectively. The results revealed that the expression changes of genes for key enzymes in the GA metabolism was one reason of the variation of 4P2-9 plant height， and the up-regulation of gene GA20ox1 and GA2ox1 expression was the main factor for the decrease of plant height.

potato；mutation of plant-height；GA；gene expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.021

2015-04-16

青海省科技廳專項資金資助項目（2013-Z-720），現代農業產業技術體系專項資金資助項目（CARS-10）

石建斌，男，博士研究生，研究方向：馬鈴薯遺傳育種；E-mail：shijanbin@163.com

王艦，男，研究員，博士生導師，研究方向：馬鈴薯種質資源創新與利用改良研究；E-mail：wangjian2197@sohu.com