斑馬魚SFPQ蛋白的原核表達及純化

楊川 胡敏

（四川大學生命科學學院，成都 610041）

斑馬魚SFPQ蛋白的原核表達及純化

楊川 胡敏

（四川大學生命科學學院，成都 610041）

Splicing Factor Proline and Glutamine Rich簡稱為SFPQ，是廣泛表達在脊椎動物中的一類蛋白。它作為抑癌基因，對生物體內腫瘤發生具有重要的調控作用。目前對于SFPQ的研究主要集中在人和小鼠上，對于斑馬魚SFPQ的研究還比較少。為了獲得原核表達的SFPQ蛋白進行下一步研究，構建了斑馬魚SFPQ-pET28a重組質粒，然后轉化到BL21化學感受態細胞中，探索用IPTG進行低溫誘導蛋白的最適條件，然后用Ni-NTA瓊脂糖鎳柱純化SFPQ蛋白。實驗結果表明，當IPTG濃度為0.75 mmol/L，誘導時間為10 h時，蛋白表達量最大，Western blot結果表明純化得到的斑馬魚SFPQ蛋白可以和抗體特異性結合，說明純化得到的斑馬魚SFPQ蛋白可以用于下一步實驗。

斑馬魚SFPQ；原核表達；蛋白純化

脯氨酸、谷氨酰胺的剪接因子（Splicing factor proline and glutamine rich，SFPQ），最先被人們發現與前體mRNA剪切相關的蛋白，分子量為72 kD，由707個氨基酸組成，堿基序列中GC含量豐富，為廣泛分布在動物體內的核蛋白［1，2］。SFPQ對DNA的修復、細胞凋亡、轉錄調控和RNA的轉運起到至關重要的作用［3］，不僅可以單獨參與DNA損傷的修復，它還可以介導DNA修復蛋白RAD51D來對DNA進行修復［4-7］，對DNA的修復起到極大的作用。

SFPQ同時也是體內重要的抑癌蛋白。在人結直腸腺癌上皮細胞中，SFPQ的沉默會導致通過caspase-3途徑的細胞凋亡的產生［8］。在人體內，SFPQ可以與非編碼RNA MALAT-1特異性結合，調控人體內腫瘤的形成［10］；人們已經發現在小鼠體內，SFPQ可以和非編碼RNA Vl30特異性結合來調節下游基因的表達［11-13］。

在小鼠大腦中，SFPQ大量富集于分化的神經元中，表明它可能與神經特異性剪切有關［14］。SFPQ也在斑馬魚的大腦發育中發揮重要作用，SFPQ缺陷的斑馬魚胚胎發育28 h后即出現死亡［15］。我們比對分析了斑馬魚SFPQ和人的SFPQ，發現斑馬魚SFPQ同樣存在RNA結合域。本研究從斑馬魚胚胎中提取總RNA，將RNA逆轉為cDNA，以cDNA為模板擴增出斑馬魚SFPQ基因，構建SFPQ原核表達載體，并對蛋白進行誘導和純化，旨在為后續研究SFPQ在斑馬魚中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 斑馬魚 斑馬魚取自四川大學生物治療國家重點實驗室斑馬魚中心。

1.1.2 表達載體及菌株 pET28a（+）原核表達載體由本實驗室保存；DH5α大腸桿菌購自南京唯贊生物公司；大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞購自全式金生物。

1.1.3 酶類與抗體PCR擴增用酶PrimeSTAR HS購自TaKaRa公司；各種限制性內切酶、T4DNA連接酶和去磷酸化酶購自Thermo公司。斑馬魚SFPQ蛋白抗提購自ABCAM公司。

1.1.4 生化試劑與試劑盒 TRIzol?Reagent購自Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購自Life Technologies公司；DNA marker購自Biomed公司；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自OMEGA公司；Ni-NTA瓊脂糖鎳柱購自QIAGEN公司；蛋白純化柱購自Bio-Rad公司；Western blot顯色液購自milipore公司。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚SFPQ基因的擴增 取發育48 h的斑馬魚胚胎，用TRIzol?Reagent提取斑馬魚胚胎總RNA，以RNA為模板，用逆轉錄試劑盒轉錄出cDNA，保存備用；在GenBank上得到斑馬魚SFPQ的全序列，根據所得序列，設計出斑馬魚擴增引物，上游引物包含Xho I 酶切位點，序列為5'-3' CCGCTCGAGCGG atggggatgcgcggtggcat，下游引物包含BamH I 酶切位點，序列為5'-3' CGCGGATCCGC GTCAGAAGCGTGGCTTCTTGG；以所得cDNA 為模板擴增斑馬魚SFPQ基因。

1.2.2 原核表達載體的構建 用Xho I和BamH I雙酶切pET28a（+）載體，去磷酸化酶處理質粒，膠回收備用；將通過PCR得到的SFPQ片段用Xho I和BamH I酶切過夜，膠回收備用；將片段連入pET28a（+）中，轉化入DH5α大腸桿菌感受態細胞中，用帶有卡納抗性的平板培養基37℃培養10-12h，挑取單菌落，提取質粒后雙酶切鑒定，將鑒定為陽性的質粒送去測序。

1.2.3 SFPQ蛋白的誘導表達 將測序正確的pET28a-SFPQ質粒轉化入BL21（DE3）大腸桿菌中，分別設置不同IPTG濃度、時間、來探索蛋白表達的最佳條件。IPTG濃度：其他條件不變，用含有卡納抗性的LB液體培養基37℃培養細菌，待OD600值達到0.6時，分別向菌液中加入終濃度為0.25、0.5，0.75和1 mmol/L的IPTG進行誘導；誘導時間：其他情況不變，分別設置4、6、8、10、12 h進行誘導。待誘導完畢后，收集菌體，棄培養基，用PBS吹懸菌體，加入終濃度為80 mg/mL的溶菌酶，冰上放置30 min，超聲波裂解細菌，超聲10 s，間歇10 s，重復6次，5 000×g離心菌體15 min，SDS-PAGE分析。

1.2.4 SFPQ蛋白的純化 取500 μL的Ni-NTA瓊脂糖鎳柱，加入純化柱中，用蒸餾水重懸珠子，待水從純化柱下方流出后，用Binding buffer（NaH2PO450mmol/L，NaCl 0.5 mol/L，咪唑（pH6.0）10 mmol/L，最終調pH為8.0）重懸，重復2次，備用；從50 mL菌液中收集細菌，5 000×g 10 min，用Binding buffer重懸菌體，加入8 mg溶菌酶，冰上放置30 min，然后用超聲波裂解細菌，30%功率，超聲10 s，間歇10 s，3 000×g離心15 min，取5 μL上清SDSPAGE跑膠分析；將離心得到的上清加入含有瓊脂糖珠子的純化柱中，4℃在旋轉儀上與珠子孵育2 h后，將上清從純化柱下方流出，取5 μL SDS-PAGE跑膠分析；用wash buffer（NaH2PO450 mmol/L，NaCl 0.5 mol/L，咪唑（pH6.0）20 mmol/L，最終調pH為8.0）洗滌樹脂，重復4次，分別取5 μL漂洗液SDS-PAGE膠分析；漂洗完畢后用elution buffer（NaH2PO450 mmol/L，NaCl 0.5 mol/L，咪唑（pH6.0）0.25 mol/L，最終調pH為8.0）洗脫蛋白，每200μL洗脫1次，重復1次，分別取5 μL漂洗液SDSPAGE膠分析，純化好的蛋白-80℃保存備用。

1.2.5 質譜分析 將純化所得蛋白送去公司進行質譜分析。

1.2.6 Western blot分析 將純化得到的SFPQ蛋白用10% SDS-page電泳分離，90 V 1 h 將蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，用鼠抗斑馬魚的SFPQ一抗室溫孵育1 h，用山羊抗鼠的二抗孵育1 h，顯色液顯色檢測。

2 結果

2.1 斑馬魚SPFQ基因的擴增

以逆轉錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增，設置不同的退火溫度，將擴增產物用1%瓊脂糖凝膠檢測，如圖1所示，當退火溫度為55.6℃時，斑馬魚SFPQ基因擴增效率最高，擴增出的片段位于marker的2 kb處，與GenBank上給出的大小符合，表明成功的擴增出斑馬魚SFPQ基因。

圖1 斑馬魚SFPQ基因的擴增

2.2 雙酶切鑒定

將含有卡納抗性的平板培養基上的單菌落挑出，用LB液體培養基培養過夜，提取質粒，用Xho I和BamH I雙酶切鑒定，用1%瓊脂糖凝膠進行檢測，結果如圖2所示，在2 kb處有一被切下的片段，表明SFPQ基因已被連入pET28a質粒中，所得的陽性質粒測序結果顯示，序列中無任何突變，閱讀框正常，表明重組pET28a-SFPQ質粒成功構建。

2.3 SFPQ蛋白的誘導表達

將重組pET28a-SFPQ質粒轉化到BL21感受態細胞中，37℃ 200 r/min培養至OD600為0.6時，加入終濃度分別0.25、0.5、0.75和1 mmol/L的IPTG誘導過夜，裂解細菌，分別取裂解液沉淀和上清用10%SDS PAGE膠電泳檢測，結果如圖3-A所示，泳道2-5和泳道7-10中，在72 kD區域均出現了目的條帶，表明SFPQ蛋白成功被誘導，且在IPTG濃度為0.75 mmol/L時，SFPQ誘導量達到最大。在探究誘導時間對SFPQ蛋白表達的影響中，分別設置了4、6、8、10、12 h不同的時間來誘導，實驗結果（圖3-B）表明，當誘導時間為10 h時，得到的SFPQ蛋白的量最大。

2.4 SFPQ蛋白的純化

將收集好菌液后，用超聲波裂解細菌，將裂解得到的上清與Ni-NTA瓊脂糖鎳柱孵育，帶有his標簽的SFPQ蛋白會與鎳柱特異性結合，如圖4第2泳道為與純化柱孵育后的上清，在72 kD左右的區域未見明顯條帶，表明誘導得到的SFPQ蛋白已結合在鎳柱上，經過4輪的漂洗，非特異性結合在鎳柱上的分子被洗脫下來，泳道7和8分別為第1次洗脫和第2次洗脫，在72 kD左右區域均出現明顯條帶，表明SFPQ蛋白被成功洗脫下來。

圖2 陽性重組子雙酶切鑒定

2.5 純化SFPQ蛋白的質譜分析

為確定純化所得的蛋白為斑馬魚SFPQ蛋白，進行了質譜分析，質譜分析結果如圖5所示，質譜得到的肽段為PKIQSAPPKIQSP，經NCBI查詢，所得肽段位于斑馬魚SFPQ中。

2.6 Western blot檢測重組SFPQ蛋白

為了進一步確定我們所純化的蛋白就是所需要的斑馬魚SFPQ蛋白，用了小鼠抗斑馬魚SFPQ蛋白的抗體作為一抗，以辣根過氧化物標記的山羊抗鼠的lgG作為二抗，進行Western blot檢測（圖6），在72 kD區域左右，PVDF膜上有明顯的反應條帶，表明斑馬魚SFPQ蛋白抗體能夠與我們純化得到的蛋白特異性結合，說明純化得到的蛋白即為斑馬魚SFPQ蛋白。

圖3 斑馬魚SFPQ蛋白的誘導表達

圖4 斑馬魚SFPQ蛋白的純化

圖5 純化SFPQ蛋白質譜結果

圖6 斑馬魚SFPQ Western Blot檢測

3 討論

SFPQ廣泛存在于脊椎動物中，它的高級結構中存在DNA結合域和RNA結合域，這對于參與核酸的相互作用具有重要的意義［2，16，17］。我們分析了人、小鼠、大鼠和斑馬魚中SFPQ的序列，發現其RNA結合域1高度保守。據報道，SFPQ在小鼠中與非編碼RNA VL30結合，調控下游反應；在人中與非編碼RNA NEAT1相結合，調控IL8的表達，發揮重要作用。因此可以選擇斑馬魚作為模式動物，研究SFPQ與非編碼長鏈RNA的相互作用。

SFPQ最開始被發現為前體mRNA的剪切因子［9］，有研究發現，在患有老年癡呆癥和皮克氏病的患者大腦中SFPQ是異常表達［18-20］；在小鼠中，SFPQ參與調控P450scc基因的表達，對于膽固醇的形成具有重要的調節作用［21］。在斑馬魚中，SFPQ蛋白的缺失導致斑馬魚胚胎在發育28 h內即死亡，表明SFPQ對斑馬魚胚胎細胞的生長具有重要的作用，尤其對斑馬魚大腦發育起至關重要的作用［16］。

本實驗從斑馬魚胚胎著手，用Trizol法提取了斑馬魚總RNA，并逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板擴增出了斑馬魚SFPQ基因，經限制性內切酶酶切后，連入pET28a載體中，為了確保我們構建的載體中沒有突變，將質粒測序，測序結果顯示構建的載體沒有發生堿基的替換、移碼等突變。為了得到原核蛋白，將重組質粒轉化入大腸桿菌BL21感受態細胞中，用不同濃度的IPTG對蛋白進行誘導，結果顯示在終濃度為0.75 mmol/L時，SFPQ蛋白表達量最大，為了測定不同的誘導時間對蛋白表達的影響，我們分別取4、6、8、10、12 h為時間點對蛋白表達進行檢測，結果表明在誘導時間為10 h時，SFPQ蛋白表達量達到最大。為了確認我們純化得到的蛋白即為SFPQ蛋白，進行了質譜分析，同時以小鼠抗斑馬魚SFPQ蛋白的抗體作為一抗做Western blot檢測，結果顯示在72 kD區域出現了明顯的條帶，說明純化得到的蛋白為斑馬魚SFPQ蛋白，并且具有抗原活性，可以用來研究非編碼RNA調控SFPQ蛋白在斑馬魚大腦發育中的機制。

4 結論

本實驗成功構建了斑馬魚SFPQ原核表達載體，純化得到了重組斑馬魚SFPQ蛋白，質譜結果和Western blot結果顯示，純化所得蛋白為斑馬魚SFPQ蛋白，可以用于研究非編碼RNA調控SFPQ蛋白在斑馬魚大腦發育中的機制。

［1］ Patton JG， Porro EB， Galceran J， et al. Cloning and characterization of PSF， a novel pre-mRNA splicing factor［J］. Genes Dev， 1993， 7：393-406.

［2］ Lee M， Sadowska A， et al. The structure of human SFPQ reveals a coiled-coil mediated polymer essential for functional aggregation in gene regulation［J］. Nucleic Acids Research， 2015， 43（7）：3826-3840.

［3］ Shav-Tal Y， Zipori， D. PSF and p54（nrb）/NonO-multi-functional nuclear proteins［J］. FEBS Letter， 2002， 531：109-114.

［4］ Ha K， Takeda Y， Dynan WS. Sequences in PSF/SFPQ mediate radioresistance and recruitment of PSF/SFPQ-containing complexes to DNA damage sites in human cells［J］. DNA Repair（Amst），2011， 10（3）：252-259.

［5］ Morozumi Y， Takizawa Y， Takaku M， et al. Human PSF binds to RAD51 and modulates its homologous-pairing and strand-exchange activities［J］. Nucleic Acids Res， 2009， 37：4296-4307.

［6］ Rajesh C， Baker DK， Pierce AJ， et al. The splicing-factor related protein SFPQ/PSF interacts with RAD51D and is necessary for homology-directed repair and sister chromatid cohesion［J］. Nucleic Acids Res， 2011， 39：132-145.

［7］ Salton M， Lerenthal Y， Wang SY， et al. Involvement of Matrin 3 and SFPQ/NONO in the DNA damage response［J］. Cell Cycle， 2010， 9：1568-1576.

［8］ Tsukahara T， Matsuda Y， Haniu H. PSF knockdown enhances apoptosis via downregulation of LC3B in human colon cancer cells［J］. Biomed Res Int， 2013， 2013：204973.

［9］ Passon DM， Lee M， Rackham O， et al. Structure of the heterodimer of human NONO and paraspeckle protein component 1 and analysis of its role in subnuclear body formation［J］. PNAS， 2012， 109（13）：4846-4850.

［10］ Imamura K， Imamachi N， Akizuki G， et al. Long noncoding RNA NEAT1-dependent SFPQ relocation from promoter region to paraspeckle mediates IL8 expression upon immune stimuli［J］. Mol Cell， 2014， 53：393-406.

［11］ Zhang JQ L， LiuX， et al. Long non-coding RNA MALAT1 promotes tumour growth and metastasis in colorectal cancer through binding to SFPQ and releasing oncogene PTBP2 from SFPQ/PTBP2 complex［J］. Br J Cancer， 2014， 111： 736-748.

［12］ Song X， Sun Y， Garen A. Roles of PSF protein and VL30 RNA in reversible gene regulation［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 102，12189-12193.

［13］ Song X， Sui AW， Garen A. Binding of mouse VL30 retrotransposon RNA to PSF protein induces genes repressed by PSF：Effects on steroidogenesis and oncogenesis［J］. PNAS， 2004（101）：621-626

［14］ Chanas-Sacre G， Mazy-Servais C， Wattiez R. Identification of PSF，the polypyrimidine tract-binding protein-associated splicing factor，as a developmentally regulated neuronal protein［J］. J NeurosciRes， 1999， 57：62-73.

［15］ Lowery LA， Sive RJ， H. Whitesnake/sfpq is required for cell survival and neuronal development in the zebrafish［J］. Dev Dyn，2007， 236：1347-1357.

［16］ Kowalska E， Ripperger JA， Muheim C， et al. Distinct roles of DBHS family members in the circadian transcriptional feedback loop［J］. Mol Cell Biol， 2012， 32：4585-4594.

［17］ Duong HA， Robles MS， Knutti D. A molecular mechanism for circadian clock negative feedback［J］. Science， 2011， 332：1436-1439.

［18］ Guttula VS， Allam A， Gumpeny RS. Analyzing microarray data of Alzheimer’s using cluster analysis to identify the biomarker genes［J］. International Journal of Alzheimer’s Disease， 2012：649456.

［19］ Ke Y， Dramiga J， Schu U. Tau-mediated nuclear depletion and cytoplasmic accumulation of SFPQ in Alzheimer’s and Pick’s disease［J］. PLoS ONE， 7（4）：e35678.

［20］ G?tz J， Matamales M， G?tz NN， et al. Alzheimer’s disease models and functional genomics— How many needles are there in the haystack？［J］Frontiers in Physiology， 2012， 3：320.

［21］ Urban RJ， Bodenburg Y， Kurosky A， et al. Polypyrimidine tractbinding protein-associated splicing factor is a negative regulator of transcriptional activity of the porcine p450scc insulin-like growth factor response element［J］. Mol Endocrinol， 2000， 14（6）：774-82.

（責任編輯李楠）

Prokaryotic Expression and Purification of Zebrafish SFPQ

YANG Chuan HU Min
（College of Life Science，Sichuan University，Chengdu 610041）

Splicing Factor Proline and Glutamine Rich（SFPQ）is a protein that expresses widely in vertebrates. As a tumor suppressor gene， it plays the vital regulation role in tumorigenesis of living organisms. So far the researches of SFPQ were focused on human being and mice，little has been known about the SFPQ of zebrafish. In order to acquire the prokaryotic-expressed SFPQ protein for further research， recombinant pET28a-SFPQ plasmid of zebrafish was constructed and transformed into the chemical competent cells of BL21. The optimal condition was explored while IPTG was applied to induce the expression of zebrafish SFPQ protein in low-temperature， and the SFPQ protein was purified by Ni-NTA agarose nickel column. The results demonstrated that the expression of the protein was the most while inducing for 10 h by 0.75 mmol/L IPTG at 27℃. The results of Western blot revealed that the purified SFPQ protein specifically bound with the antibody， indicating that the purified zebrafish SFPQ protein may be utilized in the further experiments.

zebrafish SFPQ；prokaryotic expression；protein purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.027

2015-07-28

楊川，男，碩士研究生，研究方向：細胞生物學；E-mail：108504802@qq.com

胡敏，男，博士，研究方向：細胞生物學；E-mail：gym_w@163.com