ARTP技術選育吩嗪-1-甲酰胺高產菌株及發酵優化

譚劍 熊欣 梁萬利 彭華松 張雪洪

（上海交通大學 微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240）

ARTP技術選育吩嗪-1-甲酰胺高產菌株及發酵優化

譚劍 熊欣 梁萬利 彭華松 張雪洪

（上海交通大學 微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240）

從一株高產吩嗪-1-甲酰胺（PCN）的綠針假單胞菌P3株出發，利用常壓室溫等離子體誘變技術進行誘變育種，從初篩的20株突變株中獲得了一株PCN產量達到2 093 mg/L的突變株P3-9，為出發菌株的125%。隨后通過單因素實驗考察了各種營養因子對該高產菌株合成PCN的影響，結果表明發酵培養基的最佳碳源、氮源分別為甘油和蛋白胨，外源添加Fe3+或Fe2+對于積累PCN有顯著促進作用，而添加苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸對PCN產量無明顯影響。優化后，該突變株的PCN產量高達2 810 mg/L，是目前國際上通過誘變育種獲得的較高PCN產量。

吩嗪-1-甲酰胺；常壓室溫等離子體；培養基優化

吩嗪-1-甲酰胺（Phenazine-1-carboxamide，PCN）是一種天然的吩嗪類化合物，具有廣譜的抗真菌活性，主要由假單胞菌屬合成［1-3］。與已經獲得的農藥藥證的第一代吩嗪類生物農藥——申嗪霉素［4，5］相比，該抗生素具有更好的安全性、穩定性及對植物病原真菌的抑菌活性［6，7］，在防治水稻紋枯病和小麥赤霉病等方面具有重要的應用價值［8］。據報道，目前能合成PCN的微生物菌株有綠針假單胞菌PCL1391［2］，銅綠假單胞菌PAO1［9］，PUPa3［10］，PUP6［11］，MML221［8］等，但由于PCN產率較低，尚未能大規模推廣應用。

由清華大學和北京思清源生物科技公司合作研發的常壓室溫等離子體（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變育種系統利用了ARTP在放電時產生的各種電子流對微生物基因進行損傷從而誘導其進行誘變，能在常壓室溫下操作，具有成本低、安全性高、操作簡便等優越性，取得了良好的實際應用效果［12，13］。綠針假單胞菌HT66為本實驗室從水稻根際分離的一株可以天然合成吩嗪-1-甲酰胺（PCN）的野生型菌株，PCN產量可達425 mg/L，是目前國際上報道的吩嗪化合物產量最高的野生菌株；張平原［14］從綠針假單胞菌HT66出發，經過多輪的紫外線和亞硝基胍處理，獲得了高產突變株P3，PCN產量為野生株的3.9倍。為了避免長期使用相同誘變技術導致菌株出現鈍化現象，本研究以P3為出發菌株，嘗試以一種新型的ARTP技術進行誘變育種［15，16］，并對突變株的發酵條件進行初步的優化，進一步提高PCN產量。

1 材料與方法

1.1 材料

出發菌株：綠針假單胞菌P3（Pseudomonas Chlororaphis P3），由實驗室保存。

King’s B固體培養基［17，18］（g/L）：蛋白胨20，甘油 18.915，K2HPO40.514，MgSO40.732，瓊脂20，pH 7.5。

種子培養基（g/L）：成分除無瓊脂外同King’s B固體培養基，60 mL裝于250 mL凹槽三角瓶中。

發酵培養基（g/L）：基礎成分同種子培養基，具體成分實驗中優化。

1.2 方法

1.2.1 PCN檢測方法 取24 h發酵液0.4 mL，加入20 μL 6 mol/L鹽酸酸化后，用3.6 mL乙酸乙酯震蕩萃取5 min，取0.4 mL萃取液吹干后加入1 mL乙腈溶解，以HPLC檢測。

HPLC檢測條件：色譜柱為WondaSil-WR反相柱，流動相為乙腈-25 mmol/L乙酸銨，流動相比例：0-2min，8%乙腈-92% 25 mmol/L乙酸銨；2-20 min，乙腈濃度由8%升至60%，乙酸銨濃度由92%下降至40%；20-21 min，8%乙腈-92%乙酸銨。檢測波長254 nm，柱溫30℃，流速1.0 mL/min。

1.2.2 ARTP誘變 本實驗以PCN高產突變株P3作為出發菌，利用ARTP技術對菌株進行誘變處理。取對數期的P3菌懸液（OD600值為0.6左右），用0.01 mol/L PBS緩沖液洗滌3次后取10 μL的菌液均勻涂抹于金屬載片。設置儀器功率為100 W，氣流量10 SLM，照射距離2 mm。實驗中以時間為變量，各組處理時間分別為0 s、20 s、30 s、45 s、60 s、90 s、120 s，制作致死率曲線。根據致死率，以20s照射時長為最佳誘變條件重復等離子體的照射誘變，以獲得最佳誘變效果。將誘變菌液稀釋后涂布King’s B平板，觀察菌株在平板上的生長情況，根據菌落產生PCN晶體的時間和大小初步篩選出高產突變株，最后進行搖瓶發酵，HPLC檢測PCN產量。1.2.3 不同營養因子對PCN發酵的影響

1.2.3.1 碳源的影響 在King’s B培養基中，以等摩爾數的碳原子為基準分別添加甘油、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖作為碳源，28℃，180 r/min，搖床培養24 h后檢測PCN產量，每組設3個平行實驗。

1.2.3.2 氮源的影響 根據不同氮源的含氮量，往King’s B培養基中分別添加相同摩爾量的有機氮源（蛋白胨、玉米漿、牛肉膏）和無機氮源（硫酸銨）作為氮源，其他條件同上。

1.2.3.3 微量元素的影響 根據植物根際中礦物質成分分布，分別添加Cu2+、Fe3+、Mn2+和Zn2+四種陽離子為考察對象，陽離子最終濃度為1 mmol/L，保持陰離子為Cl-，其他條件同上。

1.2.3.4 氨基酸的影響 分別添加等摩爾濃度（1mmol/L或5 mmol/L）的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸到King’s B培養基中，并設空白對照組，其他條件同上。

2 結果

2.1 誘變菌株的篩選

2.1.1 ARTP誘變致死率曲線 根據致死率公式制作綠針假單胞菌P3株的誘變致死率曲線，如圖1所示。

由圖1-A可知，等離子體照射與P3株的致死率存在著明顯的劑量效應關系。照射時間20 s時，致死率為77.54%；照射時間45-90 s時，致死率在98%以上；照射時間為120 s時，菌株被完全殺死。為保證較高的正突變率，可使致死率保持在75%左右，因此本實驗選擇20 s為最適宜的照射時長，并進行多次誘變實驗，結果如圖1-B所示。

圖1 綠針假單胞菌P3株的ARTP致死率曲線（A）和平板培養菌落圖（B）

2.1.2 誘變株篩選與PCN產量測定 經過ARTP誘變處理，根據固體平板培養基上單菌落產生綠色結晶（PCN）時間的先后和晶體量篩選出20株突變株，進行在King’s B培養基中搖瓶培養，并通過HPLC檢測PCN產量，如圖2所示。大部分初篩的誘變菌株PCN產量與出發菌株P3相比均有提高，只有少量菌株產量降低（圖2-A）；其中，誘變株P3-9產量最高，為P3株的125%左右，達到2 093 mg/L，說明ARTP誘變對于提高菌株PCN產量有著良好的效果，并選擇突變株P3-9進行后續實驗。圖2-B為突變株P3-9的HPLC檢測圖，PCN保留時間為17.199 min。

2.2 發酵優化

2.2.1 碳源對PCN合成的影響 考察5種發酵常用碳源對PCN產量的影響，結果（圖3）表明不同的碳源對PCN產量影響差異很大。其中，以甘油為碳源的培養基中PCN產量最高，為2 100 mg/L左右，而以麥芽糖作為碳源PCN產量僅為不到100 mg/L，以葡萄糖及蔗糖為碳源時的PCN產量稍高于空白組，分別為161 mg/L和234 mg/L。

圖2 ARTP誘變初篩菌株與出發菌株P3的PCN產量比（A）和菌株P3-9的HPLC檢測圖（B）

圖3 碳源對PCN合成的影響

2.2.2 氮源對PCN合成的影響 分別以有機氮源蛋白胨、牛肉膏、玉米漿和無機氮源硫酸銨、硝酸鉀為對象，考察不同氮源對PCN產量的影響，結果見圖4。由圖4可知，以蛋白胨為氮源進行發酵PCN產量最高，達2 031 mg/L，而添加工業常用的玉米漿和無機氮源硫酸銨、硝酸鉀幾乎無PCN產生。以牛肉膏為氮源PCN的產率與蛋白胨相比相對較低，僅為231 mg/L。

圖4 不同氮源對PCN合成的影響

2.2.3 微量元素對產PCN的影響 本實驗以Cu2+、Fe3+、Mn2+和Zn2+四種陽離子為考察對象，添加各種陽離子（濃度為1 mmol/L）到King’s B培養基中，陰離子均為Cl-，發酵24 h后檢測PCN產量，結果（圖5）表明，與空白對照組相比，加入Cu2+的實驗組中PCN產量反而降低，加入Mn2+和Zn2+對于PCN產量無明顯影響；而加入Fe3+對于PCN的積累有明顯促進作用，比空白對照組高出約760 mg/L，高達2 810 mg/L。

圖5 不同微量元素對PCN產量的影響

為了進一步驗證鐵離子對PCN產量的促進作用，并探究不同價態鐵離子和不同陰離子對PCN合成的影響，本實驗分別考察了2 mmol/L濃度的氯化亞鐵、氯化鐵、硫酸亞鐵和硫酸鐵對PCN合成的影響。結果（圖6）顯示，空白對照組中PCN產量為2 073 mg/L，而添加了Fe2+和Fe3+的實驗組的PCN產量普遍保持在2 800 mg/L左右，產量提高了35%，說明Fe2+和Fe3+對于促進PCN積累均有顯著效果。在同種陽離子條件下，陰離子種類對于PCN產量的影響不明顯，進一步驗證了鐵離子對于PCN產量的影響。此外，與添加Fe3+相比，添加Fe2+的PCN產量略低20-30 mg/L，且Fe2+不穩定，高溫下易被氧化，故可考慮在培養基中添加適量FeCl3溶液，提高PCN產量。

圖6 添加Fe2+和Fe3+對PCN產量的影響

2.2.4 氨基酸對PCN合成的影響 外源添加濃度為1 mmol/L和5 mmol/L氨基酸，研究苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸對PCN合成的影響。由結果（圖7）可知，與空白對照組相比，添加色氨酸后 PCN產量略微降低，由此推測可能高濃度的色氨酸對合成途徑存在一定的反饋抑制作用。添加1 mmol/L的苯丙氨酸和酪氨酸對于PCN產量無明顯影響，而當添加濃度為5 mmol/L時，苯丙氨酸和酪氨酸對于PCN的積累有輕微的促進作用。

圖7 不同氨基酸對PCN產量的影響

3 討論

假單胞菌產生吩嗪類抗生素吩嗪-1-甲酰胺具有廣譜的抑菌性，具有良好的應用前景［1-3］，但大部分研究仍處于實驗室階段，與工業化生產仍有較大差距［8-11］。本研究利用ARTP誘變育種方法對P3株進行處理，并篩選到一株產量為P3株125%的高產突變株P3-9，并對菌株P3-9的發酵培養基進行了優化。單因素實驗結果顯示，生物柴油合成工業的副產物甘油及常作為發酵氮源的蛋白胨均有利于P3-9株在發酵過程中PCN的的積累。微量元素作為生物活性物質的組成成分或新陳代謝過程中生理活性作用的調節因子，對綠針假單胞菌PCL1391中PCN的合成［19］和銅綠假單胞菌M18中吩嗪-1-羧酸（PCA）的合成［20］有著重要的影響。本研究中，外源添加Fe3+可有效促進菌株PCN的合成，與Tjeerd van Rij等［19］的結果一致，推測Fe3+可能是特定酶的輔助因子或者參與了吩嗪化合物的氧化還原反應，從而明顯地促進了次級代謝產物的合成，具體的作用機理有待進一步研究［21］。在假單胞菌的代謝網絡中，吩嗪化合物與芳香族氨基酸共用部分合成途徑［19］。但本研究中外源添加低濃度的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸對于PCN產量效果并未像PCL1391中所報道的PCN產量提高數倍的情況［19］，分析可能由于培養基中的復雜氮源已經包含少量氨基酸類物質所造成。后續可通過響應面［22］等方法研究不同營養因素對綠針假單胞菌中的PCN合成的影響，并確定最優培養基組分。另外，發酵條件如溫度、溶氧量及pH值也是影響次級代謝產物積累的重要因素，通過對發酵條件進行優化可進一步為實現工業化生產提供可能。

4 結論

（1）通過ARTP誘變實驗，制定致死率曲線并確定了最佳誘變時間20 s，并通過初篩獲得了20株誘變突變株，其中突變株P3-9的PCN產量最高，為出發菌株P3株的125%左右。由此可知，ARTP誘變育種是一種提高綠針假單胞菌PCN產量的有效手段。

（2）初步探索了培養基中各營養因子對誘變高產株合成PCN的影響，確定了用于發酵積累PCN的最佳碳源和氮源分別為甘油和蛋白胨，外源添加Fe3+和Fe2+對于積累PCN有顯著的促進作用。外源添加少量苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸對于PCN產量無顯著影響。

（3）由于工業育種技術的不斷發展和假單胞菌自身對環境的敏感性，誘變育種及發酵優化可以作為有效的手段來提高吩嗪類抗生素的產量。

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（責任編輯李楠）

Breeding of a Phenazine-1-carboxamid-producing Strain by ARTP Mutation and Its Optimization of Fermentation

TAN Jian XIONG Xin LIANG Wan-li PENG Hua-song ZHANG Xue-hong
（State Key Laboratory of Microbial Metabolism，School of Life Sciences and Biotechnology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240）

Using an atmospheric and room temperature plasma（ARTP）jet to mutagenize a phenazine-1-carboxamide-producting strain Pseudomonas Chlororaphis P3， the mutant strain P3-9 with the highest phenazine-1-carboxamide（PCN）yield of more than 2 093 mg/L was obtained from the primary-screened 20 mutant ones， and it was 125% that by the original strain. Furthermore， single factor experiment was used to investigate the effects of varied nutrient factors on the PCN synthesis of P3-9. The results showed that the best carbon source and nitrogen source were glycerol and tryptone respectively. Adding Fe3+or Fe2+had a significant effect on PCN production， and no measurable effect while adding aromatic amino acids of phenylalanine， tryptophan and tyrosine. After the optimization， the PCN yield of strain P3-9 reached 2 810 mg/L，which was the highest yield of PCN by mutation breeding in the world so far.

phenazine-1-carboxamide；atmospheric and room temperature plasma；medium optimization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.029

2015-05-08

國家自然科學基金項目（31270084），國家高技術研究發展計劃（“863”計劃）（2012AA022107），國家重點基礎研究發展計劃 （“973”計劃） （2012CB721005）

譚劍，男，碩士，研究方向：天然產物的生物合成與調控；E-mail：kevintan_2014@163.com

彭華松，男，博士，副教授，研究方向：微生物代謝調控；E-mail：hspeng@sjtu.edu.cn