阿托伐他汀對脂多糖誘導人主動脈內皮細胞細胞間黏附分子-1表達的影響*

嵇云鵬， 張彥燕， 楊　紅,3， 石廷雨,3， 徐旖旎， 陶　玲， 沈祥春,3**

(1.貴州醫科大學 天然藥物資源優效利用重點實驗室， 貴州 貴陽　550025； 2.貴州省人民醫院 藥劑科， 貴州 貴陽　550002； 3.貴州醫科大學 中藥藥理教研室， 貴州 貴陽　550025)

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·基礎研究·

阿托伐他汀對脂多糖誘導人主動脈內皮細胞細胞間黏附分子-1表達的影響*

嵇云鵬1,2， 張彥燕1， 楊紅1,3， 石廷雨1,3， 徐旖旎1， 陶玲1， 沈祥春1,3**

(1.貴州醫科大學 天然藥物資源優效利用重點實驗室， 貴州 貴陽550025； 2.貴州省人民醫院 藥劑科， 貴州 貴陽550002； 3.貴州醫科大學 中藥藥理教研室， 貴州 貴陽550025)

目的： 觀察阿托伐他汀(Atv.)對脂多糖(LPS)誘導人主動脈內皮細胞(HAECs)細胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達的影響，并探討其分子機制。方法： 用1 mg/L LPS復制HAECs損傷模型，通過MTT和乳酸脫氫酶(LDH)外漏率實驗觀察5 μmol/L Atv.對LPS誘導HAECs損傷的保護作用，采用RT-PCR法檢測Atv.對ICAM-1 mRNA表達的影響，Western blot檢測Atv.對ICAM-1、IκBα及NF-κB蛋白表達水平的影響。結果： 與LPS組比較，Atv.能有效抑制LPS誘導的HAECs損傷，細胞活力增加(P<0.01)，LDH外漏率減少(P<0.01)，Atv.可抑制LPS誘導的ICAM-1 mRNA(P<0.05)和蛋白表達上調(P<0.01)，還可抑制LPS誘導的IκBα蛋白表達水平的降低和phospho-NF-κ B p65蛋白表達水平的升高(P<0.01)。結論： 阿托伐他汀對LPS誘導HAECs損傷具有保護作用，并有效抑制ICAM-1的表達，該作用與抑制IκBα降解及NF-κB p65磷酸化有關。

阿托伐他汀； 人主動脈內皮細胞； 細胞間黏附分子-1； 核因子-κB

[Abstract]Objective: To observe the effect and mechanism of atorvastatin on the expression of ICAM-1 in lipopolysaccharide (LPS)-induced injury of cultured human aortic endothelial cells (HAECs). Methods: Cultured HAECs were treated with LPS alone (1 mg/L) or in the presence of atorvastatin (Atv.,5 μmol/L). MTT and LDH leakage ratio were used to analyze the protective effect of atorvastatin against LPS. The RT-PCR was used to determine the mRNA expression of ICAM-1. The western blot was adopted to detect the protein expression of ICAM-1, IκBα, NF-κB in HAECs injury induced by LPS. Results: Compared with LPS group, atorvastatin could effectively inhibit LPS-induced injury by increasing cell activity(P<0.01), decreasing LDH releasing ratio(P<0.01), inhibiting the up-regulating mRNA(P<0.05) and protein (P<0.01) expression of ICAM-1, inhibiting the decreasing of phospho-NF-κB p65 protein expression (P<0.01) and the increasing of IκBα protein expression (P<0.01). Conclusion: Atorvastatin has a protective effect on LPS induced HAECs injury, and can effectively inhibit the expression of ICAM-1, which is related to the inhibition of IκBα degradation and NF-κB p65 phosphorylation.

[Key words]atorvastatin; human aortic endothelial cells; intercellular adhesion molecule-1; nuclear factor-κB

細胞-細胞間黏附作用在多種刺激誘導的免疫應答中起重要作用。細胞間黏附分子-1(ICAM-1)與整合素家族成員淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)及巨噬細胞分化抗原(Mac-1)結合，介導LFA-1陽性細胞發生黏附及其它生物學反應，在單核細胞與內皮細胞緊密黏附過程中發揮著極為重要的作用[1]。ICAM-1在腦缺血、帕金森、癌癥等疾病ICAM-1表達異常升高，認為ICAM-1表達異常與肝癌、肺癌及結腸癌等腫瘤的發生發展有關[2-4]；研究還發現，動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)斑塊中和缺血再灌注損傷后的內皮細胞中ICAM-1表達也升高[5-6]，因此ICAM-1已成為預防和治療多種疾病的潛在靶點。他汀類藥物是目前臨床廣泛應用的調血脂藥，除有調血脂的作用外，還具有改善血管內皮功能、抗炎及調節免疫功能等非調血脂的作用。阿托伐他汀(Atv.)具有血藥濃度高、親脂性及半衰期長等特點。本研究通過探討Atv.對脂多糖(LPS)誘導人主動脈內皮細胞(human aortic endothelial cells, HAECs) ICAM-1表達的影響，分析Atv.作用的分子機制，為Atv.發揮抗炎作用及臨床作為非調血脂藥物應用提供依據。

1　材料與方法

1.1材料

HAEC原代細胞購買自美國Science cell公司、內皮細胞培養基(ECM)、胰蛋白酶、中和液以及細胞凍存液(science cell research laboratories, USA)，Atv.標準品(中國食品藥品檢定研究院，Lot為100590-201303)，LPS(Escherichia coli 055，B5，Sigma，USA)，乳酸脫氫酶(LDH)測試盒(南京建成生物工程研究所，Lot為20130806BCA)，蛋白定量試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司，Lot為00041305)，總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，Lot為M1726)，逆轉錄試劑盒(thermo scientific，Lot為00132311)，Taq PCR Master Mix(生工生物工程(上海)股份有限公司，Lot為13112606F)，ICAM-1抗體(Santa cruz，Lot為F0510)，兔抗IκBα抗體、phospho-NF-κ B p65抗體、NF-κ B p65抗體(Cell signaling technology)。

1.2方法

1.2.1HAECs培養參照Science cell公司指定培養條件、培養過程培養HAEC原代細胞。以5×107/L接種于培養瓶(板)內，5%CO2、37 ℃培養至細胞融合，用第4～5代細胞進行以下研究。

1.2.2分組及處理研究分為空白對照組、模型組及Atv.組，control組以無血清培養基處理，模型組采用 1 mg/L的 LPS處理培養12 h，Atv.組采用5 μmol/L的 Atv.預處理細胞1 h，然后加入1 mg/L的LPS后培養12 h，收集細胞進行后續研究。

1.2.3細胞損傷檢測(1)MTT檢測細胞存活率：取對數生長期的細胞消化后，調整細胞密度，以1×104/孔 細胞接種于96孔板；待細胞貼壁融合后棄去上清液，各組藥物干預后，吸去培養液，每孔加入無血清DMEM 180 μL及MTT液20 μL，繼續培養4 h，分離上清液，向細胞沉淀中加入150 μL DMSO低速振蕩10 min，于490 nm波長處測定各孔吸光度值，計算細胞存活率。(2)LDH外漏率：上清液LDH提取，取對數生長期的細胞接種于24孔板，各組藥物干預1 h后，加LPS(1 mg/L)共同孵育12 h，吸取上清液，-20 ℃冰箱保存，以待檢測；細胞內LDH提取，吸去上清后的細胞用PBS洗3遍，1% Triton-X100冰上裂解細胞20 min，取裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液，使用BCA試劑盒進行蛋白定量，計算胞內蛋白濃度，-20 ℃保存。根據LDH檢測試劑盒說明書檢測上清液和細胞內LDH含量，計算LDH外漏率。

1.2.4ICAM-1 mRNA檢測采用RT-PCR法，將HAEC接種于6孔板培養，細胞融合后藥物處理12 h，使用總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取細胞總RNA。以提取的RNA為模板，使用逆轉錄試劑盒(Thermo Scientific)合成cDNA， 由生工生物工程(上海)股份有限公司設計、合成ICAM-1引物，上游引物序列為5′-CCTCACACTTCACTGTCACCT-3′，下游引物序列為5′-CGTGCCGCACTGAACTGGAC-3′；內參對照GADPH上游引物序列為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物序列為5′-AGGGGCATCCACAGTCTTC-3′。擴增條件為94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，共30次循環；72 ℃最后延伸2 min；共重復3次。擴增結束后，取1×TAE電泳緩沖液，配置1.8%瓊脂糖凝膠溶液，加入無毒核酸染料，充分混勻，取5 μL PCR產物進行電泳，凝膠成像儀成像，Bandscan分析灰度值，以ICAM-1/GADPH表示各組ICAM-1 mRNA表達。

1.2.5ICAM-1 、NF-κ B及Iκ B α蛋白表達檢測采用Western blot 法，取生長良好的HAECs，各組藥物干預后，棄除含藥培養基，預冷的PBS洗3遍，加入含PMSF的RIPA裂解液適量，冰上振蕩20 min，刮下細胞，取裂解液于1.5 mL EP管內，4 ℃，12 000 r/min離心30 min，收集上清液，用BCA試劑盒蛋白定量后，-70 ℃保存。調整蛋白濃度，以含總蛋白40 μg的總體積20 μL體系上樣。蛋白樣品95 ℃變性5 min，用10%～12%的變性SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉移至PVDF膜 (300 mA，2 h)。轉膜后，5% 的脫脂牛奶 (TBST配制) 室溫封閉1 h。加入一抗稀釋液(ICAM-1 1∶200，IκBα 1∶1 000，phospho-NF-κ B p65 1∶1 000，NF-κ B p65 1∶1 000，β-actin 1∶5 000)，4 ℃孵育過夜。一抗孵育后，TBST洗滌3次，5 min/次，二抗稀釋液(1∶6 000)室溫孵育1～2 h，TBST洗滌3次，5 min/次，通過ECL化學發光法顯色，Bio-Rad凝膠成像系統成像， Bandscan軟件分析蛋白條帶灰度強弱。

1.3統計學分析

2　結果

2.1各組HAECs細胞存活率與LDH外漏率

MTT結果表明(圖1A)，LPS與HAECs作用12 h后，細胞活力較對照組細胞明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，Atv.組對LPS誘導HAEC損傷MTT值降低具有抑制作用 (P<0.01)。LDH外漏是細胞損傷的生物標志物之一，本研究結果顯示(圖1B)，與control組比較，模型組LDH外漏率明顯增加 (P<0.01)；與模型組比較，Atv.組對可顯著降低LDH外漏率(P<0.01)。

(1)與空白對照組比較，P<0.01； (2)與模型組比較，P<0.01圖1　各組細胞存活率與LDH外漏率的影響Fig.1　Effect of Atv. on cell viability and LDH releasing ratio

2.2ICAM-1 mRNA及蛋白表達

結果顯示，模型組ICAM-1 mRNA及蛋白表達明顯增高(P<0.01)，Atv.可抑制LPS誘導的ICAM-1 mRNA(P<0.05)和蛋白表達上調(P<0.01)，見圖2。

2.3NF-κ B及Iκ B α蛋白表達

與空白對照組比較，模型組HAECs中 IκBα蛋白表達明顯降低(P<0.01)，phospho-NF-κ B p65表達明顯升高(P<0.01)； Atv.組IκBα蛋白表達水平高于模型組，但低于空白對照組，phospho-NF-κ B p6蛋白表達水平低于模型組(P<0.01)，說明Atv.能抑制LPS 誘導的NF-κ B的激活。

3　討論

Atv.作為3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，具有良好的調血脂作用，特別

(1)與空白對照組比較，P<0.01； (2)與模型組比較，P<0.01；(3)與模型組比較，P<0.05圖2　Atv.對LPS誘導HAECs ICAM-1 mRNA及蛋白表達的影響Fig.2　Impact of Atv. on LPS induced ICAM-1 mRNA and protein levels, respectively

(1)與空白對照組比較，P<0.01； (2)與模型組比較，P<0.01圖3　Atv.對LPS誘導HAECs中IκBα及phospho-NF-κ B p65蛋白表達的影響Fig.3　Impact of Atv. on LPS induced IκBα and phospho-NF-κ B p65 levels

是在高膽固醇血癥的治療中得到廣泛應用。目前，Atv.仍主要用于心血管系統疾病的治療，如高脂血癥、急性冠脈綜合癥、冠狀動脈介入治療等[7]。Atv.的非調血脂作用近年來受到廣泛關注，研究證實，通過抑制TLR4/NF-κB信號，Atv.能夠改善糖尿病伴高血壓大鼠血管內皮功能，對三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的大鼠急性腸炎有保護作用[8-9]。體內、體外研究表明，他汀類藥物亦具有抗癌活性[10]。

大量研究表明以抑制ICAM-1異常過表達為靶點，對于緩解炎癥反應和免疫應答具有重要意義。本研究結果顯示，Atv.能有效的抑制LPS誘導的HAECs ICAM-1轉錄(P<0.05)及蛋白表達水平(P<0.01)。核因子-κ B(NF-κ B)在炎癥反應和免疫應答中起關鍵作用，其激活可以誘導多種炎癥因子表達，是內皮細胞炎癥信號的重要通路之一，在炎癥反應應答、細胞黏附、組織細胞凋亡有關基因表達的調控中起關鍵作用。研究證實，ICAM-1的表達受到NF-κ B調控[11]。為闡明Atv.抑制ICAM-1表達的分子機制，本研究觀察了與NF-κ B激活密切相關的蛋白IκB及磷酸化NF-κ B p65的表達情況。結果表明Atv.組較LPS組IκBα蛋白表達增加(P<0.01)，而磷酸化NF-κ B p65表達降低(P<0.01)，這表明，Atv.對ICAM-1表達的抑制作用與抑制NF-κ B的激活有關，而該作用與穩定IκBα，抑制NF-κ B p65磷酸化有關。

綜上，Atv.對LPS 誘導的血管內皮細胞損傷具有保護作用，這可能與其抑制ICAM-1的表達有關。其對ICAM-1表達的抑制作用至少部分與抑制NF-κ B激活有關，這為Atv.抗炎作用提供了實驗依據。但對Atv.在血管內皮細胞中調控NF-κ B信號通路的分子機制仍有待進一步研究。

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(2016-02-13收稿，2016-07-01修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 劉華

Effect of Atorvastatin on the Expression of Intercellular Adhesion Molecule-1 in Cultured Human Aortic Endothelial Cells Induced by Lipopolysaccharide

JI Yunpeng1,2, ZHANG Yanyan1, YANG Hong1,3, SHI Tingyu1,3, XU Yini1, TAO Ling1, SHEN Xiangchun1,3

(1.TheKeyLab.ofOptimalUtilizationofNatrualMedicineResources,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China; 2.DepartmentofPharmacy,GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,Guizhou,China； 3.DepartmentofPharmacologyofTraditionalChineseMedicine,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China)

國家自然科學基金資助項目(81360650、81560811)； 貴州省留學人員科技活動項目[黔人資合(2013)02號]； 貴州省高層次創新型人才[黔科合人才(2015)4029號]； 貴陽市現代藥業計劃[筑科合同(2011204)17號]； 貴州省中藥現代化專項[黔科合中藥字(2012)5051號]； 貴州省高等學校創新團隊[黔教合人才團隊(2014)31號]； 貴州省創新團隊[黔科合人才團隊(2015)4025號]

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R96

A

1000-2707(2016)08-0882-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.08.004

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網絡出版時間：2016-08-23網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160823.1343.036.html